握住“上帝的手术刀”

【老冀曰】

CRISPR 基因编辑是目前最红火的生物科学技术,对人类的疾病研究有重要的意义,因而被称作“上帝的手术刀”。2018年12月下旬,爱博物(北京)文化科技有限公司组织了16名中小学生前往位于青岛黄岛的国家海洋基因库,亲手进行了斑马鱼的CRISPR基因编辑实验,为孩子们揭开了基因科学的神秘面纱。

握住上帝的手术刀

爱博物CRISPR/Cas9编辑课程感悟

冀子骜/文

2018年12月下旬,我参加了由爱博物组织的基因编辑学习项目。这也是我第二次近距离地接触生命科学。2018年9月,我曾经参观过由华大基因运营的中国国家基因库,并对生命科学有了基本的了解。这次,我又来到了位于青岛黄岛的国家海洋基因库,亲手进行了斑马鱼的基因编辑实验。这个活动不仅教会了我更多有关生命科学的理论知识,也揭开了我心中操作基因编辑技术的面纱。

在这次活动中,我们学习了在生命科学领域被炒得沸沸扬扬的CRISPR/Cas9基因编辑技术。而实验目标则是对斑马鱼胚胎进行CRISPR 基因编辑,实现对斑马鱼flh基因的敲除。flh是斑马鱼基因中控制脊索发育的基因。如果实验成功,我们应该能够观察到斑马鱼胚胎的脊索比野生型更短小且弯曲。

得益于国家海洋基因库的定位和地理位置,斑马鱼在这里是实验常用的模式生物。模式生物是指那些用于揭示某种具有普遍规律的生命现象的一类生物。斑马鱼和人类的基因有87%同源,其中很多的致病机理都是相同的。并且它的性成熟周期短,产卵量大,容易饲养。因此斑马鱼是国家基因库生物科学实验的重要载体,在国家海洋基因库中就能看到大批量的自动化养鱼缸。

自动化养鱼缸的净水装置

在第二天刚刚对生命科学有了初步的了解之后,我们就进行了本次活动的第一个实验——解剖尾复虾虎。在实验课上,老师甚至开玩笑提起“清华北大欠钓鱼人一张文凭”的调侃。

在真正动手操作以后,我也体会到了要想完美地展现出鱼内部的身体构造绝非易事。对于从来没有在家中做过鱼的我来说,我对鱼肉的质感和厚度完全没有概念,对鱼的腥味也很是不习惯。根据老师的指导,我从肛门处沿着鱼的侧线将鱼的肚子剖开,却看不见任何内脏器官,通过不断地调整剪刀的角度和剪切的力度,终于将鱼的腹部完全剖开。后来发现,由于过于小心谨慎,我并没有将剪刀插入肌肉的内部。这也就证明了没有经过大量训练,是不可能很熟练而顺利地进行实验操作的。

矛尾复虾虎解剖结果

首次的实验的不顺利并没有打消我对后面的CRISPR 基因编辑斑马鱼实际操作的信心,反而激发了我的好奇心。在后续的课程中,我逐渐了解到分子生物学实验室所用的仪器和材料,与学校中的化学实验室本质上没有什么区别。但是,在国家海洋基因库的实验室中,仪器要更加齐全、精密。

以我们在为期一周的实验中几乎每天都会使用到的移液枪为例,移液枪实际上叫做微量移液器,相当于普通化学实验室中的胶头滴管,只不过它的量程和精度值都更小,是以微升为单位计量的。也正因为这个原因,移液枪使用起来要比胶头滴管难很多,我就因为操作失误而添加了过多的材料到配制容器中。

多种量程的移液枪

在了解了各种各样的生命科学的精密仪器之后,我们就开始了分子生物学以及CRISPR 技术的学习,也对高大上的 CRISPR/Cas9有了初步了解。

全体学员上课

CRISPR/Cas9 早在1997年就在大肠杆菌中被发现。科学家根据其中存储着的噬菌体RNA推测,它是细菌用来对付天敌噬菌体的获得性免疫系统。当噬菌体向细菌细胞内注入致命的RNA时,细菌内的Cas9蛋白就会在 CRISPR 系统中引导RNA(sgRNA)的指引下锁定噬菌体RNA。而Cas9蛋白就会负责剪断噬菌体RNA,使之失去活性。

然而,直到五年前 CRISPR/Cas9 系统才成功地被科学家用来在哺乳动物内进行基因编辑。人类将 Cas9 蛋白化为己用,将噬菌体 RNA 替换为了我们的目标序列。这种使人类有能力改写生命的技术也被形象地称为“上帝的手术刀”。

在这次活动中,我们也亲手配制并操控了这把“上帝的手术刀”。

首先,我们着手进行引导 RNA 的设计并在实验室中进行合成。在进行了这些实验之后,我才直观地感受到分子生物学实验实际上不如我们想象的那么直观。

和大部分的化学实验是一样的,分子生物学实验是在分子的微观层面进行的,而通过肉眼我们只能观察到把一堆原材料都兑到了一起,有时候甚至都没有颜色、形态上的变化。尤其将 DNA 模板经过 RNA 合成酶进行 RNA 增生的时侯,原料都是微量的。我们只能在实验的最后阶段,当斑马鱼从胚胎成长为仔鱼之后,才能通过观察斑马鱼性状的变化,确定实验的操作是否正确。

我在进行显微注射实验

合成 sgRNA 既然是微量的实验,这其中就少不了要用到移液枪。为了避免空气中和我们身体上携带的污染物对生成物的纯度产生影响,我们都是在精心“武装”之后才在超净工作台里进行操作的。超净工作台实际上就是一个封闭的空间加上一个过滤送风系统,戴着橡胶手套的手放在玻璃板里面进行操作都能感到丝丝凉意。

我在这个实验中添加了大约1.5μL 的 T7 RNA 聚合酶,这也是这次实验中最贵的材料——每滴的售价大概要上百元。在向 DNA 模板中添加了纯水、缓冲溶液、RNA 合成酶和 RNA 分解抑制剂之后,我们就将得到20μL的反应物,放到聚合链式反应仪中在接近人体体温的37℃下进行大约1.5小时的增生。添加进去的就是无色透明液体,而出来的还是无色透明液体。不过根据我们所学习的理论知识,我们知道里面已经发生了很多反应。如果我们的操作没有出现错误的话,就应该生成了很多我们所需要的引导 RNA。

在配制了CRISPR 基因编辑工具的引导模块以后,我们就可以将它和 Cas9蛋白混合在一起,得到一把人类梦寐以求的“上帝的手术刀”。

接下来就需要将溶液转染到斑马鱼的胚胎中了。我们使用的是一种物理转染的方法——显微注射。注射是一个精细的过程,需要用到体式显微镜、显微操作仪和数字显微注射泵。显微操作仪使用转轮进行微米级的操控,而注射泵则可以控制一帕斯卡级别的气压,从而实现定量的精准注射。显微注射已经成为了华大基因实验员的基本功,每位实验员都要一个月的集中练习才能最终实现高于95%的成功率。

图左为体式显微镜,图右为显微注射操作台和注射泵

对于我们初上手的学员来说,连续地转动旋钮进行多次注射是遥不可及的目标。能够保证一半的胚胎存活已经实属不易。我们组注射的不到二十枚胚胎中,只有五个存活且产生了可见的脊索性状突变,也有的组经历了全军覆没的悲伤和失而复得的喜悦。正如张晶老师所说:“这才是科学实验真正的魅力”。

只有通过亲身实践,才能了解科学实验的严谨和不易。对世界尖端科技更深入的了解给了我新的视野和启迪。好奇心引导着人类对生命科学永不停歇地探索,我期望能够有更多这样的机会加入到世界前沿科技的探索当中。