较真丨对抗新型冠状病毒,萘莫司他可能比瑞德西韦更有效

较真要点:

  • 1跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)是一类位于细胞膜上的蛋白,研究发现它能激活SARS病毒的S蛋白,并诱导病毒与靶细胞融合,促进其感染。不过病毒感染的过程对TMPRSS2和病毒S蛋白的空间定位是有要求的,TMPRSS2必须要在S蛋白对面的膜上表达才能激活S蛋白。
  • 22016年的一项研究指出,丝氨酸蛋白酶抑制剂萘莫司他是中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的有效抑制剂,类似结构的卡莫司他对MERS也有抑制作用,这说明它们同样有可能抑制新型冠状病毒。3月18日日本东京大学医科学研究所亚洲传染病研究基地公布的最新研究成果印证了这一推测。
  • 3萘莫司他抑制新冠病毒感染的原理是,通过抑制靶细胞上的TMPRSS2,阻断TMPRSS2切割病毒S蛋白的过程,从而使病毒与靶细胞的融合受阻,以抑制整个感染过程。萘莫司他以1-10nM的低浓度就可以显著抑制病毒侵入,比目前已知的瑞德西韦抑制效果要好,且病毒不会产生耐药性。

查证者:VC丨病原生物学博士,科普作者

日本TBS电视台3月18日报道,日本东京大学医科学研究所亚洲传染病研究基地的井上纯一郎教授与山本瑞生助教宣布,发现丝氨酸蛋白酶抑制剂“萘莫司他”能够抑制新型冠状病毒感染人体细胞的膜融合过程,笔者非常看好这一科研进展。虽然当前相关论文并未发表,但已经召开了发布会,并发布了一份相关介绍文件。

文件中提到的药物有两个,一个是萘莫司他(Nafamostat),另一个分子结构类似的是卡莫司他(Camostat mesylate)。其实与萘莫司他相关的还有一个萘莫司他甲磺酸盐,也就是剂型不一样的同样效应分子

下图为文件中描绘的萘莫司他抑制新冠病毒感染的机制,萘莫司他是文章开头日本教授提到的“丝氨酸蛋白酶抑制剂”,而图中的TMPRSS2就是该抑制剂的作用对象——跨膜丝氨酸蛋白酶2。

一、萘莫司他是怎么抑制新冠病毒感染的

SARS-CoV-2要进入细胞(入胞),需要与细胞表面的受体(ACE2)结合,然后诱导病毒包膜与细胞膜发生融合。

而病毒表面的刺突蛋白S,在成熟的过程中会被细胞里面的弗林蛋白酶(Furin)切割,形成两个蛋白亚基S1和S2。但是S1和ACE2结合以后并不能直接诱导病毒的包膜与细胞膜的融合,还需要在S2上再切一刀,将其中的融合肽(FP)暴露出来,才能实现病毒包膜与细胞膜的融合,这个切割过程就是由TMPRSS2来执行的。

为什么一定要将融合肽暴露出来呢?融合肽是一小段氨基酸链,其侧链R基团都是疏水性的基团,它们可以插入细胞膜的磷脂双分子层,从而诱导病毒包膜与细胞膜的融合。

所以,只需抑制TMPRSS2,就可以阻断融合肽的暴露,从而阻断融合肽的R基团插入细胞膜的磷脂双分子层,抑制整个感染过程。针对这个靶标的新冠药物是值得期待的。

二、TMPRSS2是如何被发现的

萘莫司他抑制冠状病毒感染的相关研究,还要从2010年发表于美国微生物学会《病毒学杂志》的一篇文章说起。该文章标题为“跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)有效激活严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白”(原标题见下图)。研究人员来自日本国立传染病研究所病毒学部和病理学部,以及日本兽医与生命科学大学兽医学院。

这篇文章从现有的SARS-CoV的受体ACE2不能解释病毒的体内组织细胞嗜性(ACE2在很多组织中都表达,但病毒却主要侵袭肺部)的角度出发,认为病毒感染过程中还存在有别于ACE2的宿主决定因子,并最终鉴定出来了TMPRSS2。这个分子高表达于肺上叶,研究发现它能激活SARS病毒的S蛋白,并诱导病毒与靶细胞融合,促进其感染。

该研究利用非洲绿猴肾细胞(Vero)来表达TMPRSS2以供研究。在SARS-CoV感染时,多个细胞可以被诱导形成合胞体(syncytia),合胞体是病毒感染细胞之后产生的一种病变,指很多个细胞融合在了一起,形成有很多细胞核的巨大细胞。

研究发现,在表达TMPRSS2的细胞中产生的病毒,其S蛋白并不被同细胞的TMPRSS2裂解,TMPRSS2促进SARS-CoV的感染是在入胞阶段,而不是融合已经完成的阶段。TMPRSS2影响病毒入胞,但不影响病毒复制的其他阶段。

最后一个有意思的实验是发现TMPRSS2必须要在S蛋白对面的膜上表达才能激活S蛋白,从而形成合胞体,也就是说,TMPRSS2促进病毒感染这个过程,对TMPRSS2和病毒S蛋白的空间定位是有要求的,TMPRSS2不切割本细胞病毒的S蛋白,只切割对面的待融合细胞病毒的S蛋白。

三、如何利用这个特点去寻找有效药物

还是日本的团队。作者分别来自日本东京大学医学研究所亚洲传染病研究中心,日本东京国立传染病研究所第三病毒部,中国科学院生物物理研究所结构病毒学与免疫学研究室等。

2016年,他们在美国微生物学会的《抗微生物药物和化学疗法》杂志发表了一篇题为“以分裂蛋白为基础的细胞-细胞融合实验鉴定出萘莫司他是中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S蛋白介导的膜融合的有效抑制剂”的文章(原标题见下图) 。

这篇文章建立了一种筛选体系,通过靶细胞上表达MERS-CoV的受体CD26和TMPRSS2这个酶,同时细胞内有一半的蛋白质亚基(绿色);效应细胞上表达刺突蛋白S,同时细胞内有另一半的蛋白质亚基(蓝色),两个细胞融合以后,两个亚基配对,这样就可以发光了。通过荧光强度可以推测细胞融合的量。

利用这个体系,他们筛选了1017种FDA批准的药物,使用的浓度统一是1个微摩尔(1μM),结果发现萘莫司他的抑制效果好得不得了,产生的荧光强度只有对照的1.66%,并且排除了药物本身对荧光的影响,也就是说,筛选到的萘莫司他能有效抑制两个细胞的融合,以抑制病毒感染。

那么这种细胞融合抑制体系筛选到的萘莫司他是不是真的对冠状病毒感染有抑制作用呢?答案是肯定的。萘莫司他和类似结构的卡莫司他对MERS-CoV都有抑制入胞的作用。

这个特点是不是也可以用来针对新型冠状病毒?答案也是肯定的。

3月初,由德国科学家发表在《细胞》的一篇文章就验证了卡莫司他对新型冠状病毒假病毒的入胞抑制作用。这里的假病毒指的是只具有病毒包膜蛋白的病毒颗粒,可以模仿病毒结合受体入胞,但是不能复制。

从该研究中可以看到,卡莫司他对新型冠状病毒的抑制作用还可以,虽然不如针对MERS-CoV或者SARS-CoV的有效浓度低,但是效果已经非常好了。

四、日本东京大学现在的新进展体现在哪里?

因为文章没有发表,我们可以从新闻里提取关键信息:萘莫司他以1-10nM的低浓度就可以显著抑制病毒侵入

这其实也就是说,10个纳摩尔的浓度就能阻断病毒的入胞了,这个比瑞德西韦的半数有效浓度还要低。之前武汉病毒所体外筛选的结果显示,瑞德西韦半数有效浓度(EC50)为 0.77 μM(CC50 > 100 μM,SI>129.87) 。

但是武汉病毒所当时也筛选了萘莫司他,结果却显示这个药物的效果不尽如人意(EC50 = 22.50 μM,CC50 > 100 μM,SI> 4.44),不知道是评价方法不一样造成的,还是说病毒所使用的这个药物本身效力低。

虽然研究结果不同,但至少我们现在清楚了只要抑制TMPRSS2就可以抑制冠状病毒的入胞,且只需利用以上两个药物就可以实现。

瑞德西韦针对的是病毒的RdRp(RNA依赖性的RNA聚合酶),这就存在病毒发生突变从而产生耐药性的情况。而萘莫司他针对的是宿主的蛋白酶TMPRSS2,病毒再突变,宿主的蛋白酶分子也不会变,所以一般不会产生耐药性

本文编辑:ambergchen

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