新冠检测为何有假阴性？北京疾控中心等发现：或因样本热灭活

自2019年底新冠疫情暴发，核酸检测对患者诊断和疾控管理发挥了重要作用。然而实际检测中，却经常有假阴性的情况发生。假阴性可能会导致病毒携带者被漏诊，尚无康复的患者误出院，以及输血中的一些潜在安全问题。

那么假阴性的原因有哪些？来自中国的研究发现，对检测样本的热灭活，可能是假阴性的一大原因。当地时间5月15日，美国临床化学协会与牛津大学出版社合作出版的国际领先的临床实验室科学期刊Clinical Chemistry刊发了来自北京疾病预防控制中心、北京市预防医学研究中心、首都医科大学、中国医学科学院老年医学研究院、中国医学科学院北京协和医学院和北京医院的论文“Potential False-Negative Nucleic Acid Testing Results for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Thermal Inactivation of Samples with Low Viral Loads”。

论文称：为了安全，国家卫健委相关指南要求在提取样本核酸前需将样本置于56℃以上以灭活病毒。但是，热灭活本身可能会破坏作为单链RNA的新冠病毒的核酸完整性，并在RT-PCR测试中出现假阴性。

这项研究的通讯作者为北京市疾控中心传染病地方病控制所所长、研究员王全意和来自中国医学科学院老年医学研究院的任思楣。

研究团队调查了热灭活是否会影响病毒核酸检测的结果。研究者检查了热灭活对SARS-CoV-2定量RT-PCR结果的影响，特别是对于携带低病毒载量的标本的假阴性结果的比率。研究者还探讨了不同样品类型，样品保存时间和化学灭活方法对核酸检测的影响。

目前，中国已有100多家企业开发了用于新冠核酸检测的试剂盒，其中9个已获得国家药品监督管理局的批准。经过国家药品监督管理局批准的试剂盒，在临床试验中对确诊病例的样品均显示出90％以上的高灵敏度。但是，在实际的临床环境中，疑似患者的阳性诊断率没有评估的那么高。许多疑似患者表现出与肺炎一致的典型临床症状或影像学研究，但在RT-PCR测试中未发现阳性。这就提出了一个问题，是什么导致这些临床上的假阴性？

国家药品监督管理局批准的试剂盒通常来说质量都是非常高的，而操作者也不太可能因为核酸提取和检测程序不当产生大量假阴性。那么，临床上收集的样品类型（比如，是热灭活还是化学灭活）可能是导致RT-PCR测试性能低于预期的主要原因之一。

考虑到SARS-CoV-2是单链RNA病毒，分离其基因组需要谨慎处理样品，并保持良好的实验室操作规范。SARS-CoV-2具有很强的传染性，许多实验室在提取RNA之前，已对样本进行56-60°C灭活30-60分钟，以保证操作人员的安全。尽管学术界怀疑这种预处理可能会影响低病毒载量样品中SARS-CoV-2的检测，但对其影响的定量分析仍然不足。此次研究中，研究者调查了热灭活对SARS-CoV-2核酸检测结果的定量影响，并评估了由于热灭活引起的假阴性率。研究者进一步研究了不同样品类型，样品保存时间和化学灭活方法对核酸检测的影响。

该研究显示，从确诊的COVID-19患者的标本经过热孵育后，在RT-PCR测试时Ct值较热灭活前的样板升高（编注：Ct值与病毒载量成反比，Ct值升高，意味着测试出的病毒载量偏低）。此外，在至少一项平行测试中，加热灭活后的弱阳性样品中约一半（15个样品中的7个，占46.7％）成为RT-PCR阴性。研究者发现，与热灭活相比，使用胍盐裂解法保存这些样品对RT-PCR结果的影响较小，假阴性更少（15个样品中的2个，占13.3％），Ct值的增加也明显更少。

本研究采用的样本来自北京23名已确诊的新冠患者。研究收集了19个咽拭子，2个痰样本和2个粪便样本。将4支咽拭子和痰标本保存在3 µmL标准病毒运输液（VTM）中。其他15支弱阳性喉拭子保存在3 µmL标准病毒运输液或者3 µmL的化学灭活的缓冲液中。粪便样本保存在采样管中。所有样品都保持在4°C并在4小时内转移到实验室。

研究发现热灭活可以导致RT-PCR检测中病毒核酸的可检测量减少和Ct值增加（Ct值与病毒载量成反比），这一结果与最近的猪流行性腹泻病毒模型的研究结果一致。热灭活对携带高病毒载量的标本的定性结果没有显著影响。但是，对于弱阳性样本（Ct值范围为33.37至36.89），热灭活可能是实验室检测SARS-CoV-2时假阴性结果的可能原因之一。

据推测，热失活可能会对早期感染患者的检测产生潜在影响，导致核酸检测无法在患者病毒载量尚低时就检测出来。在研究中，近一半的弱阳性样本（15个样本中的7个，占46.7％）显示假阴性结果。这7个样本的平均Ct值（36.25）相当于约700拷贝/ mL，这也可能是热敏感的可能阈值。

因此，研究者呼吁，迫切需要提高实验室检测的准确率。采用化学灭活剂，例如胍盐类的RNA样本保存制剂，可以视为避免生物安全风险的替代方法。研究结果表明，与低病毒载量样品中的热灭活相比，这些灭活剂可能有更好的测定性能和检测率。但是，化学灭活剂的狭窄适用性，有限的可获得性和潜在的环境污染，限制了它们在SARS-CoV-2测试中的应用。

附：实验结果