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世界卫生组织（WHO）统计显示，截至3月13日，全球共有41个候选疫苗在研发。另外一组统计数据是，截至3月17日，全球至少有96家公司和学术团体宣布66个新冠病毒疫苗开发计划[1]。
据国家卫健委医药卫生科技发展研究中心介绍，目前国内新冠疫苗攻关工作正沿着5条技术路线推进，即：灭活疫苗、重组亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、核酸疫苗[2]。
本文拟介绍这5种新冠疫苗技术路线的原理、研究进展、特点及其生产工艺。
01
研发中的新冠疫苗
1.灭活疫苗
灭活疫苗是指将病毒经适当的方法进行批量培养并灭活处理之后制备而成的疫苗[3]。病毒灭活疫苗是一种经典的疫苗形式，也是一种易于快速研究和制备的有效疫苗。通常在发生病毒性传染病时，往往优先选择针对该病毒的灭活疫苗。
在已经上市的疫苗中，以灭活疫苗居多，例如狂犬病灭活疫苗、流感灭活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等[3][4]。
据报道，国内有多家公司和机构研发新型冠状病毒的灭活疫苗，见表1。
表1 研发新型冠状病毒的灭活疫苗的单位
（来源于公开信息）
灭活疫苗的优点是：
（1）相对于减毒活疫苗，安全性好；
（2）相对于亚单位疫苗，具有完整的分子空间结构，抗原成分的空间结构比较接近原始状态；
（3）相对于减毒活疫苗，易于储存和运输。
灭活疫苗的缺点有：
（1）相对于减毒活疫苗，产生免疫力需要长时间；
（2）相对于减毒活疫苗，接种途径少；
（3）相对于亚单位疫苗，副作用较大；
（4）相对于亚单位疫苗，批间差控制难度稍大。
2.重组亚单位疫苗与多肽疫苗
重组亚单位疫苗主要是通过基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗，以及将抗原组装成病毒颗粒样（VLP），从而形成VLP疫苗。基因工程表达的抗原不但可以代替传统的方法生产抗原，而且还可以用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或免疫病理作用的疫苗。
多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过合成技术制备的疫苗[3]。
随着生物技术尤其是结构生物学的发展，通过结构改造设计疫苗的报道如雨后春笋般涌现。比如，将病原体的含抗原决定部位的蛋白嫁接到骨架上或者固定成特定目标结构，从而引起机体中和抗体的产生[9][10]。
已经上市的亚单位疫苗产品有重组带状疱疹疫苗、基因工程乙型肝炎疫苗、基因工程人乳头瘤疫苗、基因工程戊型肝炎疫苗等[3]。
据报道，国内已经有多家公司和机构启动新冠病毒重组亚单位疫苗的研究，如中科院微生物研究所、智飞生物、宇之波生物、昭衍生物、神州细胞[7] [11]等。上海在新闻发布会上透露某公司制备的病毒样颗粒（VLP）疫苗的小鼠免疫实验已产生特异性抗体[12]。北京康乐卫士将新冠病毒的最有效的抗原成份（表位）基因拿出来，插入到其它病毒的结构蛋白基因中，进行体外重组和融合蛋白表达，制成多肽疫苗，正在动物体内进行测试[13]。
康众生物采用一种创新的人工合成病毒样颗粒（Synthetic Virus-like Particles, SVLP）核酸递送技术，制备重组蛋白疫苗佐剂，模拟病毒的天然结构及自然感染过程，具有快速诱导机体产生极强的体液免疫和细胞免疫应答的优势。动物实验结果表明，免疫后7天即可获得足够高的S1抗体效价，三周后抗体平均效价达1:600万以上，实验动物对疫苗制剂耐受良好[14]。
值得注意的是三叶草生物制药公司在哺乳动物细胞内成功表达“S-三聚体”新型冠状病毒重组蛋白疫苗。用新获得的“S-三聚体”抗原在多例病毒感染患者康复后血清中检测到病毒特异性抗体。这一结果表明“S-三聚体”重组疫苗保留了新冠病毒S-蛋白抗原天然的结构，因此“S-三聚体”疫苗有望在人体中诱导保护性的免疫反应[15]。
表2 研发新型冠状病毒重组蛋白疫苗的单位
（来源于公开信息）
亚单位疫苗与多肽疫苗优点是：
（1）产量大、纯度高；
（2）副作用小；
（3）安全性高，针对性强；
（4）一定程度上可以避免抗体依赖性增强效应（antibody-dependent enhancement, ADE）。
亚单位疫苗与多肽疫苗缺点有：
（1）成本较高；
（2）依赖佐剂甚至受佐剂制约。
3.载体疫苗
载体疫苗是指利用微生物，如某些细菌和病毒做载体，将保护性抗原重组到微生物中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。常见的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、甲病毒复制子等[3]。
已经上市的载体疫苗有重组埃博拉病毒疫苗（腺病毒载体）[16]。
由康希诺联手军事科学院军事医学研究院生物工程研究所研发的重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)已经处于临床阶段[17]。另外，杨森生物、武汉博沃等单位也正在研发病毒载体新冠疫苗[11][18]。
值得关注的是，厦门大学和长春百克生物等单位联合研发的减毒流感病毒载体新冠疫苗也在研发中，该类疫苗可以通过鼻腔滴注方式接种[19]，如果研制成功有利于提高疫苗接种率。该流感病毒载体疫苗正在进行实验动物的安全性和有效性研究，预计4月底完成候选疫苗的临床前研究[20]。
表3 研发新型冠状病毒载体疫苗的单位
（来源于公开信息）
载体疫苗优点是：
（1）无需佐剂，载体本身可发挥佐剂作用；
（2）诱导体液免疫和细胞免疫，甚至粘膜免疫；
（3）纯化简单；
（4）可以同时表达多个抗原做联合疫苗。
载体疫苗缺点有：
（1）机体中和抗体中和；
（2）有一定的安全隐患。
4.核酸疫苗
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导机体产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的[3]。
核酸疫苗一般分为DNA疫苗和mRNA疫苗两种。相比前面几种疫苗，核酸疫苗生产工艺相对简单[21]，尤其是mRNA疫苗无需细胞培养或动物源基质、合成速度快、成本低。mRNA疫苗发挥作用无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，且为一过性表达，半衰期可以通过修饰进行调整。因此，mRNA疫苗的发展前景比较明朗[22]。
目前上市的核酸疫苗主要是DNA疫苗，且都为兽用疫苗，如西尼罗病DNA疫苗（马用）、犬黑色素瘤DNA疫苗[3]；国内有预防H5亚型禽流感的DNA疫苗[23]。值得关注的是很多mRNA疫苗产品已经进入临床阶段。比如，BioNTech针对黑色素瘤个性化肿瘤疫苗在II期临床，前列腺癌、乳腺癌等的mRNA疫苗在I期临床中；CureVac针对非小细胞肺癌、黑色素瘤的mRNA疫苗在I期临床；Moderna针对黑色素瘤的mRNA疫苗已经开展II期临床；Tuebingen大学针对黑色素瘤的mRNA疫苗已经完成I/II期临床[22]。
美国生物科技公司Moderna的新冠病毒mRNA试验性疫苗，跳过动物实验，直接开始人体试验[24]。德国CureVac公司日前也已宣布，将尽快且安全地将候选mRNA疫苗推进临床试验[25]。
表4 研发新型冠状病毒核酸疫苗的单位
（来源于公开信息）
核酸疫苗的优点是
（1）工艺简单、成本低；
（2）无需佐剂；
（3）可对肿瘤疾病发挥作用；
（4）DNA疫苗自带佐剂功能；
（5）mRNA疫苗研发、生产时间短，易于放大；
（6）mRNA疫苗特别适合突发性传染病。
核酸疫苗缺点有：
（1）DNA有整合宿主基因组的风险；
（2）RNA容易降解。
（3）mRNA疫苗需要修饰和递送系统。
此外，还有一些新技术和优势平台也在参与或助力新冠病毒疫苗研究。
北京鼎成肽源生物与贝达药业合作，针对新冠病毒研发的抗新冠病毒通用型细胞疫苗已进入动物实验阶段，预计4月下旬进行临床研究[26]。
澳大利亚昆士兰大学正利用一种“分子钳”技术能够增加病毒蛋白的稳定性。研究人员尝试利用该技术开发针对埃博拉病毒、流感病毒等疫苗，已取得非常理想的实验效果。该校研究团队目前已获得新冠病毒的基因序列，正处于研制疫苗的初期阶段。
英国葛兰素史克（GSK）公司将与国际组织“流行病防范创新联盟”合作，推进新冠病毒疫苗的全球研发。该公司的优势技术之一，就是对于疫苗生产十分重要的佐剂[24]。
02
新冠疫苗有关的生产工艺
1.病毒类疫苗
病毒类疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗，以及病毒载体疫苗（以病毒为载体的活疫苗），这些类型的疫苗生产工艺类似。相对来说，灭活疫苗主要是多了灭活的步骤，需要更大的生产规模，同时下游纯化也稍微复杂，制剂需要佐剂增强抗原的免疫作用。而减毒活疫苗和病毒载体疫苗生产规模相对较小，下游纯化简单，一般无需佐剂。
病毒培养历经动物器官培养、禽胚培养，到现在大部分利用细胞培养，包括原代细胞和传代细胞。原代细胞无转化性质，但容易产生批间差，而且容易污染。传代细胞批间差异小，有利于大规模培养，但具有转化性质。现在大部分疫苗采用传代细胞进行大规模培养。
人用病毒疫苗生产常用的细胞有Vero细胞、人二倍体细胞等，多为贴壁细胞，使用细胞工厂培养或使用微载体在生物反应器中培养，在培养基中添加牛血清的细胞培养方式。
病毒载体疫苗生产常用HEK293细胞来扩增载体病毒，因为部分载体病毒对血清敏感，大多采用无血清培养方式。还有一些制备载体疫苗的病毒载体是使用禽胚进行培养的。
细胞培养制备病毒培养物经过破碎、过滤后称为病毒原液。对于灭活疫苗在病毒灭活以后需要进一步纯化，甚至还需浓缩病毒。然后配制如稀释或加入佐剂。
图1. 病毒类疫苗生产工艺示意图
图1是病毒类疫苗生产工艺示意，研发中的新冠灭活疫苗和病毒载体疫苗基本都采用类似生产工艺生产，但减毒流感病毒载体新冠疫苗可能例外。
国内流感病毒疫苗采用鸡胚病毒扩增的生产工艺，虽然国内已经有MDCK细胞培养工艺的禽用禽流感疫苗上市，但人用流感疫苗还一直使用鸡胚生产工艺。国外流感疫苗生产工艺有鸡胚扩增病毒扩增工艺，也有细胞培养工艺，包括Vero细胞、MDCK细胞、EB66细胞等。
2.重组蛋白类疫苗
重组蛋白类疫苗主要有重组亚单位疫苗、VLP疫苗等，表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞，应根据蛋白抗原的特点选择表达系统。
大肠杆菌表达会涉及包涵体变性复性，但培养基要求简单。
酵母菌表达重组蛋白中使用较多的是毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母等，培养基要求也不复杂。
昆虫细胞培养杆状病毒表达常用的昆虫细胞有Sf9细胞、Sf21细胞等，采用无血清培养基在生物反应器中培养。
制备重组蛋白疫苗常用的哺乳动物细胞HEK293、CHO等，采用无血清培养基在生物反应器中培养。
表5 不同表达系统的优势和劣势
不同表达系统的下游纯化方面差异很大，应该根据表达蛋白特点选择纯化工艺。
图2. 重组蛋白类疫苗生产工艺示意图
图2是重组蛋白类疫苗生产工艺示意，研发中的重组亚单位新冠疫苗和病毒颗粒样（VLP）疫苗一般采用类似生产工艺生产。
3.核酸类疫苗
核酸类疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。
DNA疫苗生产工艺相对简单，其中工程菌的发酵和纯化是影响DNA疫苗产量和生产成本的两个关键环节[21]。
图3.DNA疫苗生产工艺示意图
图3是DNA疫苗生产工艺示意，研发中的DNA新冠疫苗一般采用类似生产工艺生产。
mRNA疫苗产业化容易，速度快，成本低，从基因测序至生产只需要数周的时间，因此在对时间要求比较紧急的疫情中有望发挥重要作用。
图4. mRNA疫苗生产工艺示意图
图4是mRNA疫苗生产工艺示意，研发中的mRNA新冠疫苗一般采用类似生产工艺生产。
面对新冠疫情，全球疫苗公司八仙过海、各显神通，基于自己公司的平台研发新冠疫苗。进展较快的是美国Moderna的新冠病毒mRNA疫苗和国内康希诺腺病毒载体疫苗，均已经进入临床阶段[17][24]。但疫苗的研发需要较长的过程。第一个阶段是疫苗前期研发过程，包括获得免疫原、免疫反应测试、动物保护测试、生产工艺优化、临床前毒理研究等环节；第二个阶段是疫苗研发及注册过程，包括临床前研究、申报临床、完成临床试验，最后才能实现疫苗上市[27]。
到底哪些疫苗能够杀出重围，造福人类，让我们拭目以待！
（2020年3月29日）
参考资料
[1]https://tech.sina.cn/2020-03-20/detail-iimxyqwa1921329.d.html?vt=4&pos=18
[2]https://www.sohu.com/a/379014480_651392
[3]赵铠. 疫苗研究与应用[M].人民卫生出版社，2013
[4]https://vaccines.procon.org/view.resource.php?resourceID=005206
[5]https://www.cnbg.com.cn/content/details_12_5017.html
[6]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1659282207935481591&wfr=spider&for=pc
[7]http://finance.eastmoney.com/a/202003061408290143.html
[9]Ofek G , Guenaga F J ,Schief W R , et al. Elicitation of structure-specific antibodies by epitopescaffolds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 2010, 107(42):17880-17887.
[10]Zhang B , Chen L , SilacciC , et al. Protection of calves by a prefusion-stabilized bovine RSV Fvaccine[J]. npj Vaccines, 2017, 2(1):7.
[11]https://zhuanlan.zhihu.com/p/109389993
[12]http://dy.163.com/v2/article/detail/F7SQGCM30537A5Y9.html
[13]https://www.bj-klws.com/html/news/enterprise/158201799602333.html
[17]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1661374254295106009&wfr=spider&for=pc
[18]http://zhengce.chinabaogao.com/yiyao/2020/0394RE92020.html
[19]https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_6336769
[20]https://new.qq.com/omn/20200318/20200318A06EFH00.html
[21]陈光明,刘玉华. 核酸疫苗制备工艺研究进展[J]. 生物技术通讯, 2006(06):129-131.
[22]http://finance.ifeng.com/c/7v2p2iv1Bzd
[23]http://hlj.ifeng.com/a/20180531/6618718_0.shtml
[24]http://news.39.net/kyfx/200318/7808983.html
[25]https://c.m.163.com/news/a/F5GNEG6J00018AOQ.html?spss=wap_refluxdl_2018&spssid=57bb9a8658d39b2db9ba6b3ea54bd32a&spsw=1&isFromH5Share=article
[26]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1662219513632681831&wfr=spider&for=pc
[27]https://baijiahao.baidu.com/s?id=1658407441041283592&wfr=spider&for=pc
来源：生物咖啡茶