近日，杜克大学医学中心Bryan团队与北卡罗来纳大学Ronald等在国际权威期刊Cell Host & Microbe在线发表了题为“Acetylation of cytidine residues boosts HIV-1 gene expression by increasing viral RNA stability”的研究论文，重点关注了新型RNA表观修饰-ac4C在HIV-1病毒感染中的重要作用，为HIV的治疗提供了潜在的新靶点，也为深入了解表观转录组提供了方法学的指导。
标题与图片摘要
表观转录组修饰，即发生在mRNA核苷酸分子上的共价修饰，这种特殊的修饰在细胞及病毒基因表达中发挥重要功能，逐步成为近些年研究的热点。RNA甲基化能够促进包括HIV-1在内的多种病毒复制，之前的研究检测并定位了HIV-1转录本的几种表观遗传修饰，包括腺苷6号位N甲基化(m6A)、胞苷5号位C甲基化(m5C)和2’-O甲基化(Nm)，其中m6A促进病毒RNA表达，m5C增强病毒翻译，Nm则抑制宿主因子MAD5从而维持病毒复制。最近的研究在细胞中发现了一种新的修饰方式——胞苷4号位乙酰化(ac4C)，能够提高mRNA的翻译的稳定性，研究者推测该机制可能也存在HIV-1中促进病毒的基因表达。利用光辅助交联ac4C特异性抗体与RNA测序，发现在细胞内HIV-1转录本中存在11个保守的ac4C修饰位点。通过分析宿主转录组ac4C的定位，多数修饰位点位于编码区，也有小部分在3’非翻译区，但都含有UCU基序的特征。为证实修饰位点的确是ac4C，研究者猜想敲除添加乙酰化的标签蛋白（哺乳动物中为NAT10），研究者借鉴之前的方法基于CRISPR技术对T细胞NAT10 5号外显子进行编辑，发现ac4c修饰确实显著下调。为更加直观地显示NAT10与RNA的相互作用，研究者采用光辅助交联-免疫沉淀技术，与之前结果相吻合。
ac4C修饰位点
由于ac4C位点同时存在于病毒和细胞RNA上影响mRNA稳定性，因此研究者通过分析HIV复制来间接反映ac4C对病毒RNA的影响。在NAT10敲除细胞中可以明显观察到病毒Gag结构基因、病毒RNA表达量下调，荧光素酶也具有相似的实验结果。研究者利用NAT10强效抑制剂Remodelin在正常细胞中重复了这一过程，能够降低七成的病毒复制，而对NAT10细胞病毒复制不起作用，因此NAT10可能是HIV的重要辅因子。
敲除实验
为了进一步研究NAT10在HIV感染中的作用，通过过表达/功能缺失实验，结果发现NAT10过表达细胞HIV载量显著高于其他组。那么NAT10是通过哪一步骤调节HIV复制的，研究者通过单轮HIV-1复制实验，发现Gag蛋白和病毒RNA下降水平基本一致，暗示主要作用于RNA水平。m5C修饰对病毒mRNA翻译起主导作用，而ac4C的影响不明显，降低ac4C修饰并没有直接影响HIV-1转录本亚细胞定位、可变剪接，入侵细胞、逆转录、整合等过程也不受影响。通过脉冲追踪、放线菌素D抑制转录发现NAT10/ac4C实际是通过影响HIV-1转录本稳定性。
ac4C修饰对HIV的影响
之前的研究发现ac4C除了影响mRNA稳定性，还可以提高翻译效率，可能存在顺式作用。通过在HIV包膜基因env内引入C-U突变，并转染CD4阴性293T细胞，也观察到了env基因上游的gag基因表达下调。为了排除破坏其他重要基因的可能，分别分析野生型和突变型细胞衣壳蛋白p24和Gag表达量，p24表达量变化高于总Gag。
ac4C修饰作用机制
该研究结构思路清晰，综合运用多种方法科学严谨地证实结论。研究者通过将最新发现的RNA修饰与病毒感染相联系，通过运用敲除/过表达、抑制剂等证实ac4C主要通过影响病毒RNA稳定性调节病毒增殖，为后续的深入研究提供了借鉴。NAT10可能是HIV感染重要的靶标，基于ac4C的靶向抑制剂Remodelin可能作为良好的治疗药物。
本期编辑：Reynard Fox
审阅：Tony
素材来源：Cell Press
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文献链接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(20)30293-6