双交联PEG水凝胶，为何能登上《自然·材料》？

小鼠肿瘤来源的基质胶Matrigel一直以来被广泛用作于天然细胞外基质(ECM)的替代品，因可以在体外再现组织和疾病生物学，成功地从干细胞衍生出类器官，为基础研究、药物发现和再生医学开辟了令人振奋的前景。然而，虽然类器官在基础生物学中是很有价值的模型系统，但对它们的探索才刚刚开始，这主要是因为它们目前主要依赖于如Matrigel等化学成分不明确的动物源性基质。该绊脚石可以通过合成化学成分确定的水凝胶来克服，但目前这些系统的非生理性的机械特性严重妨碍了培养的类器官的正常生长。

可促进上皮干细胞生长的基于聚乙二醇(PEG)的水凝胶已被广泛报道，洛桑理工学院Matthias P. Lutolf团队设计了一种基于两种不同多臂PEG大分子交联的杂合网络结构水凝胶:一种是通过Michael加成共价交联；另一种是通过在生理pH下，胞嘧啶可以与它的互变异构体形成三个氢键从而实现可逆交联。通过可逆氢键介导的动态重排可促进类器官形态发生。而通过温和的迈克尔加成控制交联的杂合网络，不仅可以降低固相含量，增加凝胶稳定性，还可以避开由于pH值改变或暴露于高温带来的潜在细胞毒性，因此更适合 3D 细胞培养应用。该工作以“Synthetic dynamic hydrogels promote degradation-independent in vitro organogenesis”发表在《Nature Materials》。

作者首先介绍了前驱体的三步化学合成步骤：首先合成疏水的连接头（11-巯基十一烷酸，连接头上带有-COOH），再将其与单官能团线性PEG-乙烯基砜（mPEG-VS）反应形成mPEG-COOH，最后羧基连接胞嘧啶得到（mPEG）-胞嘧啶。为了生成3D水凝胶网络，使用类似的方法，以八臂PEG-VS(8-PEG-VS)作为起始大分子单体，先合成了前驱体（8-PEG-COOH50），其中一半的端基为疏水性接头，而另一半保留为VS基团。最后用胞嘧啶或苯胺修饰所有-COOH基团，得到8-PEG-胞嘧啶50与无氢键对照组8-PEG-苯胺50。可能由于多臂PEG的树枝状结构，DLS测量显示所有大分子单体都具有复杂的三峰尺寸分布，具有高聚集粒径。振荡流变测定表明在三种大分子单体冷却过程中复数粘度的演变存在差异，表明通过氢键物理交联的特定性和渐进性参与。从65℃冷却过程中的傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示了三个区域的显着红移（酰胺I C=O拉伸区域1600–1800 cm-1，酰胺II N-H弯曲区域1500-1600 cm-1和酰胺A N-H拉伸区域，约3300 cm-1)，提供了氢键的额外证据。

图1：PEG-胞嘧啶50的合成和设计

前体合成后，通过共聚8-PEG-胞嘧啶50和八臂硫醇官能化PEG（8-PEG-TH)合成了杂合PEG水凝胶，由通过迈克尔加成反应形成的共价键和通过三重氢键形成的物理键共交联。原位振荡剪切流变测定表明，Hybrid50水凝胶在37°C和中性pH值下快速形成，PEG含量相关的凝胶动力学范围为52±26 s（4.5% w/v)至334±119 s（3% w/v）。与Hybrid50凝胶相比，共价凝胶在所有PEG浓度下都表现出更高的刚度，这可归因于共价键的强度更高。而通过将Hybrid50凝胶暴露于至少50倍过量的游离胞苷（40mg ml–1)，会导致所有浓度的凝胶刚度降低，证实了氢键参与交联。最后在37°C的细胞培养基中测试了水凝胶7天的稳定性。Hybrid50水凝胶表现出与共价凝胶相似的稳定性，与之前报道的可水解降解水凝胶形成了鲜明的对比。

在37°C下进行了恒定剪切变形测量，并监测了应力随时间的衰减。正如对天然ECM衍生材料所预期的那样，Matrigel显示出显着的应力松弛特性（~98%），特征衰减半衰期τd1/2为68 s，与软组织的公开数据一致。相比之下，共价凝胶在τd1/2时几乎没有应力松弛(~3%) 且τd1/2>300 s，这可能与水的运动和缠结的聚合物链相关。而以相同硬度配制的Hybrid50凝胶表现出明显的应力松弛特性(~10%)，τd1/2为24 s，与Matrigel相对相似。

图2：Hybrid50水凝胶的合成和机械特性

接下来，作者评估了水凝胶支持干细胞3D扩增和类器官图案化的能力。由于小鼠肠道类器官形态发生较为经典，会形成包括所有关键细胞类型的隐窝-绒毛结构，将小鼠肠道类器官作为该体系的模型系统。在增殖培养条件下，单个小鼠肠干细胞(mISCs)在合成水凝胶和Matrigel中均发育成顶端极化的上皮囊肿，在1 kPa下具有最佳的克隆形成效率。与已发表的数据一致。换成分化培养基后，类器官很容易在Matrigel中形成，但在不可降解的共价凝胶中，上皮的克隆仍然是囊性的，没有明显的出芽结构。而与共价凝胶相比，Hybrid50水凝胶在所有硬度中都促进了更高水平的出芽和隐窝-绒毛形态发生，300 Pa时形成的效率最高（~35%），尽管这与Matrigel相比效率仍然较低。总体而言，这些数据表明，合成的水凝胶允许干细胞分化和类器官形成，而不受水凝胶网络降解的影响。

最后，为了扩展杂合水凝胶在重复细胞传代的长期类器官培养中的适用性，作者根据之前的工作对水凝胶进行了修饰优化，用于人类小肠（hSI）类器官的扩增培养。明场成像表明hSI类器官可以在杂合水凝胶中传代至少五次，平均扩增效率对于每个传代是2到3倍，具有冷冻和解冻类器官的重要可能性，尽管这与Matrigel相比效率较低（3到7倍）。基因表达分析详细说明了在水凝胶中生长的类器官与Matrigel对比的分化情况，可能是由于基质硬度的差异，水凝胶中干细胞标志物OLFM4和LGR5被下调，这解释了与Matrigel相比水凝胶的总体扩增能力较低的原因，但也说明了该水凝胶对人类肠道类器官长期培养的适用性。

图3：Hybrid50水凝胶支持从单细胞形成小鼠肠道干细胞衍生的类器官

图4：将杂合水凝胶应用扩展到长期hSI类器官培养

研究者设计了一种基于两种不同多臂PEG大分子交联的杂合网络结构水凝胶，与传统的合成水凝胶相比，该工作合成的水凝胶基质能够适应组织扩张和发育过程中发生的机械变化，而不受不可逆网络退化的影响，可用于类器官的长期培养。

来源：高分子科学前沿

声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！