上世纪六十年代，DDT 尚在广泛使用，《寂静的春天》一书可谓横空出世，振聋发聩：过度使用农药无异于饮鸩止渴。虽然如此，为了满足人口增长对粮食产量的要求，农药的用量从 1950 年已增长了 50 倍之多，年用量约 250 万吨。
消费者期待着无污染、有机食品，科学家亦从未停止对农药的突破：从高毒到低毒的化学农药，从化学农药到昆虫 / 植物生长调节剂，从外施用药到转抗病虫害基因作物，从一味消杀到构建生态平衡...... 一路寻找更加具备特异性的方法，尽可能利用自然本身存在的现象与规律来 “一物降一物”。
自 1998 年 RNAi 机制在秀丽隐杆线虫的基因表达中被发现以来，迅速成为研究基因功能的有力工具；“指哪打哪” 的作用特点预示着它在人类医药和农业等领域有广泛的应用空间，麦肯锡报告将 RNAi 农药列为未来 10 年间将爆发的生物技术领域之一。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）：
指由双链 RNA 诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。RNAi 由长双链 RNA (dsRNA)、小干扰 RNA (siRNA)、基于质粒或病毒的短发夹 RNA (shRNA) 或 microRNA (miRNA) 触发。其中，dsRNA、shRNA 和 pre-miRNA 需由 Dicer 切割成 siRNA 发挥作用。siRNA 与细胞质内的 Ago 蛋白组装形成 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC)。RISC 组装过程中，正义链（ssRNA）被消除，反义链 RNA（asRNA）产生活性 RISC，触发靶 mRNA 的降解或翻译抑制。
近日，生辉 Agri Tech 与香港小默生物技术有限公司 (以下简称 “小默生物”) 的创始人、昆山杜克大学副教授黄林峰博士聊了聊。黄林峰拥有 18 年小核酸研究经验，并利用该技术开发了高效、精准、直接、绿色的生物农药。
黄林峰教授于 2003 年获得中国农业大学生物科学学院理学学士学位。后在牛津大学的生态与水文中心进行学术访问，随后在英国约翰英尼斯中心塞恩斯伯里实验室 (Sainsbury Laboratory, the John Innes Centre) 跟随小干扰 RNA （siRNA）发现人 Sir David Baulcombe 教授攻读博士学位，并于 2009 年获得东英吉利大学博士学位。2009-2014 年在美国波士顿儿童医院和哈佛医学院跟随 siRNA 治疗专家 Judy Lieberman 教授进行博士后研修。2014 -2020 年，在香港城市大学生物医学系担任助理教授和副教授（终身教职）。2020 年 9 月加入昆山杜克大学，担任生物学副教授（终身教职），2021 年获昆山双创领军人才。
图 | 小默生物创始人黄林峰（来源：受访人提供图丨点击照片查看企业详细信息）
打破技术壁垒的明星 CP：小核酸 + P19 蛋白
小干扰 RNA（Small interfering RNA，siRNA），也称小核酸，最早由黄林峰的导师 Sir David Baulcombe 教授团队发现，是植物转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象的一部分，其研究结果于 1999 年发表于Science，仅稍晚于获得诺贝尔奖的 RNAi 现象在秀丽隐杆线虫中的发现。2001 年，德国生物化学家和分子生物学家 Thomas Tuschl 团队发现合成的 siRNA 可诱导哺乳动物体内的 RNAi 作用，成果发表于Nature。这项发现使业内认识到可以利用可控制的 RNAi，进行生物医学研究与药物开发。
图 | siRNA 作用机制（来源：受访人提供）
“siRNA 最初是在植物里面发现的，跟植物抗病毒和抗转基因有关，是植物面对外来核酸的天然免疫机制。” 博士毕业后，黄林峰设想如何将这项技术应用到与人类健康更相关的领域，比如开发医药。“我觉得 RNAi 医药是重要的发展方向”，怀揣如此抱负，黄林峰去往美国哈佛医学院，研究如何用 siRNA 治疗病毒。
彼时，siRNA 以化学合成和酶反应合成居多，但成本较高；而由细菌合成的长双链 RNA 又难以纯化，且极易引起免疫反应。大规模生产 siRNA 成为其商业化应用的阻碍。
幸运的是，黄林峰在研究中偶然发现了一种能够在细菌中越过长双链 RNA、直接高效生产 siRNA 的方法，打开了生物制造 siRNA 的全新思路。
植物为抑制病毒而产生 siRNA，而植物病毒为了抑制 siRNA 则产生了一种称为 P19 的蛋白。“P19 蛋白可以像海绵一样吸附植物的 siRNA，在细菌中能稳定原本不稳定的 siRNA，最终还有助于将 siRNA 特异性地纯化出来。” 黄林峰解释道。
P19 蛋白特殊的生化性质使得利用细菌生物工程直接生产 siRNA的方法成为可能。他们选取大肠杆菌作为载体，并将 siRNA 靶标序列和 P19 蛋白克隆到质粒中，对 siRNA 进行提取纯化。这项研究成果以题为 “Efficient and specific gene knockdown by small interfering RNAs produced in bacteria”于 2013 年在发表在Nature Biotechnology。这种细菌生产的 siRNA 被命名为 pro-siRNA（原核小核酸），这项技术后来取得独家授权专利，迄今为止为小默生物独家拥有。
这项技术不仅实现了生产方式上的突破，所产生的 siRNA 也更具优势。化学合成一次只能生产出单一序列的 siRNA；而利用细胞工程，通过基因的转录、处理产生 siRNA 的过程中，长 dsRNA 被 RNase III 家族酶（包括细菌 RNase III 和真核生物的 Dicer）加工后产生了针对一个靶基因的多种序列的 siRNA。这样的 siRNA 库通常比单一序列更有效，可以协同抑制靶基因，减少脱靶效应。
（来源：受访者提供）
“这套技术发明后，我意识到它可能带来一些产业上的应用”，黄林峰便萌生了创业的冲动，“siRNA 在医学上当然有应用，但在农业上，未来也可能会有广泛的应用。因为农业也已经进入到了精准农业、生物农业的阶段。”
但在当时，这项技术尚未成熟，产量不理想，每升只能提取出几十微克产品。黄林峰团队继而探索了 siRNA 生产的关键因素，如细菌培养基、dsRNA 生成方法、RNase III 活性、细菌发酵条件和纯化程序，将产量提高了几百倍，将纯化方法大大精简，可以大规模工业化生产。
但 siRNA 应用还面临另一个难题，即开发原创的、高效的、适合 siRNA 应用的基因靶点。“为此，我们开发了一套具有‘个性化’的 RNAi 高通量筛选技术。可以把一个物种，比如一个细胞系或者一种造成农业病害的物种中的所有 mRNA 转化成相应的 siRNA 文库。然后通过高通量筛选找到最适合的 siRNA 基因靶点。” 黄林峰介绍道。
2019 年，基于 RNAi 生物生产和靶点开发的一整套平台技术，小默生物正式落地，入驻香港科学园生物创业孵化器（Incu-Bio），并获香港政府的大力资助。“小默 ‘Xiaomo’ 跟小米只差一个字母”，黄林峰谈到愿景，“我们的目标就是做生物技术里面的‘小米’，用最简单、最经济的方法，做最高效的生物产品开发。”
生物农药和医药两手抓
基于 RNAi 建立的各种技术通常被称为小核酸技术，其适应症涵盖范围广，包括肿瘤、罕见病、病毒性疾病、心血管疾病、炎症类疾病等。目前，全球有 4 款 siRNA 类小核酸药物获批上市，小核酸药物逐渐成为生物制药领域的必争之地。
除此之外，RNAi 在未来食品安全和保障所需的综合害虫管理和可持续农业战略上也发挥着重要作用。国际上的几家农业公司巨头均在开发 RNAi 生物农药，如拜耳、巴斯夫和先正达 (曾收购 deVGen)。
（来源：生辉根据公开资料整理）
据黄林峰介绍，小默生物的产品管线主要分为生物农药和医药两大类，其中生物农药主要包括基于 RNAi 的杀虫剂和杀真菌剂，而杀真菌剂是进展最快的管线。“公司期望与大型农业公司合作，把管线扩展到更多病原体物种上，包括土壤害虫、病毒。在生物医药方面，利用个性化 RNAi 高通量筛选发现疾病治疗新靶点的技术已经在跟中国大陆的公司合作。”
农药产品在实际应用中，往往需要考量其作用靶标、递送效果、抗性、对非目标物种和环境的影响等问题。
关于脱靶问题，黄林峰坦言，任何一个基因药物，都有脱靶效应。脱靶效应指序列上的脱靶，即 siRNA 会对除了靶点基因以外其他的基因产生抑制。但基因药物相对于其他现有小分子，是更精准的。且脱靶效应是有办法被控制的：1）针对同一基因使用多个 siRNA 序列，如小默生物现在所做的；2）通过序列的选择，把可能带来脱靶效应的，即同源性比较高的基因片段剔除，使用比较特异而保守的序列；3）利用更好的高通量方法检测可能的脱靶效应；4）通过特定的化学修饰降低脱靶效应。
针对 RNAi 农药常常面临的递送问题，则要分情况讨论。农业上的很多病害物种不需要设计特殊的递送系统，因为低等真核生物对环境中的 RNA 更敏感：昆虫和线虫可以通过取食吸收 RNA；某些真菌可以直接吸收环境中的 RNA。“但是对于病毒，比如植物病毒，可能就需借助纳米颗粒将 siRNA 送入植物细胞内。”
理论上 RNAi 农药环境友好性更高。传统化学农药的弊端不必赘述；抗生素或其他对害虫产生干扰的小分子药物，作用并不精准，容易产生抗药性，影响到非目标物种，还会进入食物链，更大范围地污染环境。“而 siRNA 目标精准，对人和环境是无害的，特别是对人没有毒性，因为高等生物的细胞不能直接吸收环境中的 RNA。另外，RNA 是可生物降解的。” 不过，黄林峰也透露，公司目前尚未在开放式环境中做 siRNA 农药的环境安全性评估实验。
“在中国，我们是第一家公开的 RNAi 农业公司，并拥有自主的 RNAi 平台技术。” 黄林峰表示，“香港科学园提供了世界级的研发平台，香港政府也在全力支持生物科技产业的发展；但我们在香港的规模还是非常小的。未来，小默生物希望进行融资，把业务扩展到大陆，与大型农业公司合作。我们的目标是发展成中国的 GreenLight，在 RNAi 生物农业新产业的全球竞争中占据领先的位置。”
参考资料：
[1] https://rnajournal.cshlp.org/content/13/4/431.full.pdf+html
[2] https://cn.agropages.com/News/NewsDetail---20772.htm
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