类器官（Organoids）是一种基于3D体外细胞培养系统建立的与体内组织或器官高度相似的一种模型，能最大程度模拟人体器官，是促进个体疾病研究和个性化治疗的强大系统。类器官培养技术在 2017 年被 Nature Method 评为年度生命科学领域的年度技术后，相关研究逐年增加，并且已成为肿瘤研究的最佳模型，并被预测为下一个诺贝尔奖。今天我们将通过一篇发表在oncogene的文章向大家介绍使用类器官发表高分文章的方法。
一、研究背景
5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种被称为抗代谢物的关键抗癌药物，通常用作胃癌（GC）的一线治疗药物。尽管5-FU化疗有时可以达到完全的病理消退率，但并非所有患者都表现出肿瘤消退，并且许多患者在治疗后会出现复发。越来越多的研究表明，癌症干细胞 (CSC) 在获得耐药性方面发挥着关键作用。作者建立了GC类器官 (GCO)，并给予不同浓度5-FU处理，成功得到四种抗5-FU的GCO。通过表达谱的比较和进一步的验证筛选出靶基因进行研究。
二、研究方法及结果
研究方法：
Figure1：首先作者构建了5-FU天然耐药及敏感类器官诱导继发耐药类器官。
Figure2：使用微阵列数据进行主成分分析 (PCA) 敏感型类器官和继发耐药类器官的基因表达差异，寻找靶点。
Figure3：通过大量临床样本验证筛选基因的临床病理相关性，并且评估所筛选的基因是否能够为临床预后进行分类，在单变量和多变量 Cox 比例风险分析中评估了其表达与癌症特异性死亡率之间的关联。
Figure4：在耐药类器官上敲除所筛选的靶点：使用 CRISPR/Cas9技术进行敲除，并证明了此基因敲除拥有显着更高的化学敏感性。
Figure5：在敏感类器官中过表达筛选基因，进一步阐明筛选基因在获取干细胞特征中的重要作用。
结果：
1.构建胃癌类器官，并检测IC50，明确原发敏感及耐药类器官，将敏感株诱导为耐药株， 通过相差显微镜下和H&E染色评估细胞形态，结果显示，5-FU 抗性 GCO 的 IC50 值比亲本 GCO 高 3.9 至 9.6 倍，5-FU抗性的代表性指标胸苷酸合酶(TS)和二氢嘧啶脱氢酶的 mRNA表达水平，在5-FU抗性GCO中显着上调。
2.将亲本敏感类器官及诱导耐药类器官进行对比，进行转录组学比较差异基因。结果显示 KHDRBS3在两个5-FU抗性细胞系中中都没有上调，并且在5-FU抗性GCO中显示出显著上调。测定 10 个 GCO 中 KHDRBS3 的 mRNA 表达水平显示，KHDRBS3表达与GCO对5-FU的敏感性显着相关。
3.使用临床样本验证所筛选到的靶点KHDRBS3在胃癌中高表达，IHC临床样本验证KHDRBS3与接受氟尿嘧啶治疗胃癌患者生存预后的相关性。Kaplan-Meier 分析显示 KHDRBS3 阳性 GC 病例的存活率显着降低，这些结果支持支持KHDRBS3可能是GC患者的生物标志物，特别是对于接受5-FU化疗的GC患者。
4.在继发性耐药类器官上敲除KHDRBS3，并进行WB及IHC验证；敲除KHDRBS3后，进行了MTT 活力测定，并证实 KHDRBS3敲除GCO和GC细胞对包括5-FU、奥沙利铂 (L-OHP)和曲氟尿苷(FTD)在内的代表性抗癌药物显示出显着更高的化学敏感性。敲除KHDRBS3显著降低了类器官生成的效率及其大小。异种移植肿瘤测定实验结果显示KHDRBS3 的敲除抑制了肿瘤的生长。
5.在原发敏感类器官上过表达KHDRBS3，并进行WB及IHC验证。过表达KHDRBS3，并进行氟尿嘧啶IC50检测，发现过表达KHDRBS3后类器官对氟尿嘧啶的IC50上升，变得更为耐药。之后作者评估了过表达 KHDRBS3的GCO形成，并确定KHDRBS3的过表达提高了类器官生成的效率并扩大了它们的大小。这些结果与敲除 KHDRBS3在GC细胞和类器官中获得的数据完全相反，进一步支持KHDRBS3在获得GC干细胞特征和维持这些细胞的过程中发挥着重要作用。
三、总结
本研究成功了建立5-FU抗性GCO，并发现 KHDRBS3通过调节CD44v表达在GC癌症干细胞群中获得多药耐药性中起重要作用。尽管KHDRBS3对GC进展没有作用，但KHDRBS3 是GC潜在的独立预后因素。本研究为预测GC患者的治疗价值和预后提供了潜在的候选标志物，也突出了GC癌症干细胞中获得 5-FU 抗性潜在机制的关键。
基于以上研究内容，我们发现类器官具有极高的创新性，在疾病研究、肿瘤药敏、药物毒理、临床免疫等多个领域都有重要的应用，使用类器官发表文章及申请国自然都有很高的中标率。
编辑：Catherine
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