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肺癌是全球癌症死亡相关的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）最为普遍[1]。
目前仅有部分NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法响应良好[2]，因此探究肿瘤微环境（TME）中调控抗肿瘤免疫的因素至关重要。
除了肿瘤突变负荷和肿瘤细胞PD-L1表达外，CD8+T细胞的浸润水平也能够预测免疫疗法响应，尤其是浸润到肿瘤实质内的CD8+T细胞[3-6]。因此，研究肿瘤排斥T细胞的机制，将有助于提高免疫治疗疗效。
近日，由西奈山伊坎医学院的Hélène Salmon带领的研究团队，在著名期刊Cancer Discovery发表重要研究成果[7]。
他们发现，在NSCLC中有两类癌症相关成纤维细胞（CAFs），它们都能通过生产胶原纤维，沉积在肿瘤实质周围，发挥T细胞排斥作用。
这项研究对CAFs如何调控T细胞排斥提供了见解，同时也为靶向CAFs的免疫治疗增强策略提供了新靶点。
论文首页截图
在NSCLC的肿瘤与基质的交界处，有一层致密的胶原，它包裹着肿瘤组织，形成一个保护屏障，阻止T细胞与肿瘤细胞相互接触[8]，然而这些胶原的细胞来源仍然未知。
在次级淋巴器官中，成纤维细胞可以通过分泌趋化因子，作为引导树突状细胞和淋巴细胞迁移和相互作用的支架，在淋巴细胞区室化中发挥重要作用[9-11]。然而，成纤维细胞在肿瘤基质中如何调控局部抗肿瘤反应，尤其是调控免疫细胞的空间分布仍然未知。
虽然目前有研究报道CAFs能够调控肿瘤免疫及肿瘤进展，但是在肿瘤中靶向CAFs的疗效并不明显[12,13]。因此，深入理解CAFs的分子特征，以及各种亚群CAFs对于免疫细胞的调控作用，将有助于精准调控特异的CAFs亚群，并发挥最好的抗肿瘤效果。
在这项研究中，Hélène Salmon带领的团队，对15例手术切除的NSCLC样本及配对的12例相邻组织进行单细胞测序，鉴定了4种主要的CAFs亚群（ADH1B+CAF、FAP+CAF、FAP+αSMA+CAF和MYH11+αSMA+CAF）。并对35例NSCLC样本进行多重荧光免疫组化染色，以验证单细胞测序的发现。
NSCLC中成纤维细胞分型及染色鉴定
通过对单细胞测序及多重荧光免疫组化染色的结果进一步分析，研究团队发现ADH1B+CAF高表达T细胞募集驻留相关基因CCL19、CCL21和VCAM1，这一表型与次级淋巴器官中的成纤维网状细胞相似[14]。
因此研究团队进一步探究了ADH1B+CAF与三级淋巴结构的关系，结果显示，ADH1B+CAF定位于三级淋巴结构的T细胞区。
既往研究报道NSCLC中存在MHC-II高表达的CAF[15]，而MHC-II一般表达于专职抗原呈递细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞，这提示某些CAFs亚群可能存在抗原呈递功能。
为了探究哪种CAFs亚型与抗原呈递有关，研究团队利用单细胞测序数据分析了各亚型CAFs中MHC-II的表达情况。他们发现高表达CCL19的ADH1B+CAF有最高水平的MHC-II表达。这些结果提示，定位于三级淋巴结构的ADH1B+CAF可能发挥抗原呈递作用。
ADH1B+CAF定位于三级淋巴结构并高表达MHC-II
为了探究这4种CAFs亚群和NSCLC肿瘤分期的关系，研究团队将单细胞测序结果和患者临床信息联合分析。
他们发现ADH1B+CAF和MYH11+αSMA+CAF主要富集于早期肿瘤中，而FAP+CAF和FAP+αSMA+CAF主要富集于晚期肿瘤中。
NSCLC早期和晚期肿瘤分别富集了不同亚型CAF
由于ADH1B+CAF主要分布于早期NSCLC中，而FAP+CAF主要分布于晚期NSCLC中。研究团队为揭示NSCLC进展过程中成纤维细胞的转录组改变，他们分析了ADH1B+CAF、FAP+CAF和两类正常肺组织成纤维细胞（PI16+fib.和alv.fib.）的转录特征。
他们发现FAP+CAF高表达CAFs活化相关基因COL1A1、COL3A1、BGN，低表达正常肺泡成纤维细胞标志物TCF21、MME（CD10）、ELN；而ADH1B+CAF能表达正常肺成纤维细胞（PI16+fib.和alv.fib.）的标志物，ADH1B+CAF中的FAP+CAF活化相关基因表达水平中等。
多重荧光免疫组化染色结果也显示，ADH1B+CAF主要位于肿瘤侵袭前沿，FAP+CAF主要位于肿瘤中心，部分CAF同时存在这两类细胞的标志物表达。
有趣的是，单细胞测序结果也提示，ADH1B+CAF兼具PI16+fib和FAP+CAF的转录特征。
这些结果都提示：ADH1B+CAF可能是一种来源于PI16+fib的低活化水平的成纤维细胞。
ADH1B+CAF和FAP+CAF的转录特征
为了验证ADH1B+CAF和FAP+CAF区分NSCLC分期的能力，研究团队利用单细胞测序数据提取了ADH1B+CAF和FAP+CAF的基因特征，使用TCGA数据集进行验证。
对TCGA数据的分析表明，ADH1B+CAF基因特征在早期肿瘤、肺腺癌（LUAD）和LUAD乳头型中富集，而FAP+CAF基因特征在晚期肿瘤、肺鳞癌（LUSC）和LUAD实体型中富集。
这些结果提示NSCLC中成纤维细胞分子分型可以用来改进NSCLC的临床分型。
为了探究不同CAFs亚型能否调控肿瘤微环境内免疫浸润，研究团队利用单细胞测序数据对CAFs亚型富集与免疫细胞浸润情况进行分析。单细胞测序数据显示，FAP+CAF与SPP1+单核细胞来源的巨噬细胞，IgG+浆细胞和PD-1+T细胞的富集相关，这一结果与最近报道的肺癌活化模块[16]所描述的免疫细胞类型相似。
值得注意的是，尽管ADH1B+CAF和FAP+CAF与浸润的免疫细胞种类相关，但它们的丰度与T细胞的空间分布无关。
既然这两类CAFs与T细胞排斥无关，那么其他类型的CAFs是否与T细胞排斥有关呢？对MYH11+αSMA+CAF浸润情况分析后发现，MYH11+αSMA+CAF形成单层结构包绕癌巢，能够阻碍T细胞进入肿瘤实质。
MYH11+αSMA+CAF可以发挥T细胞排斥作用
FAP+αSMA+CAF同样能够发挥T细胞排斥作用，但分布情况与排列方式与MYH11+αSMA+CAF有所不同。MYH11+αSMA+CAF主要分布于早期肿瘤，在癌巢周围单层排列，而FAP+αSMA+CAF主要分布于晚期肿瘤，在癌巢周围呈多层或片状分布。
FAP+αSMA+CAF可以发挥T细胞排斥作用
研究团队进一步探究了这两类有T细胞排斥功能的CAFs亚群，在细胞外基质重塑方面的作用。
结果显示，这两类CAFs亚群都能通过产生胶原来重塑细胞外基质，其中MYH11+αSMA+CAF主要产生IV型胶原，而FAP+αSMA+CAF主要产生XI和XII型胶原。
MYH11+αSMA+CAF和FAP+αSMA+CAF产生不同类型的胶原纤维
总而言之，该研究鉴定了NSCLC的4种CAFs亚群，及不同CAFs亚群与免疫细胞空间分布的关系。
首先，研究团队发现ADH1B+CAF和FAP+CAF与NSCLC组织学亚型和肿瘤分期相关，这有助于对NSCLC亚型进行精确的分子分型。
其次，研究团队鉴定了1种与抗原呈递相关的CAFs亚型ADH1B+CAF，促进CAFs向这种亚型分化可能有助于提高抗肿瘤免疫疗效。
第三，研究团队发现FAP+CAF与NSCLC中的T细胞分布模式无关，这可能是靶向FAP+CAF的治疗策略失败的原因。
第四，研究团队鉴定了两种与T细胞免疫排斥相关的CAFs亚型MYH11+αSMA+CAF和FAP+αSMA+CAF，这为靶向CAF的疗法提供了更精准的靶点，由于靶向细胞外基质中的胶原存在脱靶风险，靶向这两种形成胶原的细胞可能更加合适。
该研究的模式图
这项研究提示我们CAFs在塑造NSCLC肿瘤微环境方面能够发挥重要作用；在诊断方面，可以利用CAFs亚型可以对肿瘤进行分子分型；在治疗方面，靶向CAFs亚型也有助于提高现有的免疫治疗疗效。
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