当今世界塑料经济以“获取原料-生产制造-消费使用-废物丢弃”的线性经济模式为主，塑料制品的广泛应用在为人们带来极大便利的同时，也导致了塑料的白色污染，对自然环境和人类健康产生了严重的负面影响。
PET（polyethylene glycol terephthalate，聚对苯二甲酸乙二醇酯）是白色污染的主要来源，自然条件下，需要 300 年以上才能被完全降解。
尽管一些 PET 水解酶在 50℃ 以上的反应温度下，对无定形的 PET 材料显示出很高的活性，但在相同的反应条件下，结晶度更高的 PET 被降解的程度要小得多。因此，在自然界中，PET 水解酶无法短时间内完全降解结晶度较高的 PET。
与文献报道的 PET 水解酶相比，被称作能“吃”塑料的 IsPETase 在常温下 PET 降解活性最高，但 IsPETase 热稳定性较差，且 MHETase 水解酶活性很低（可将单羟乙基对苯二甲酸酯（MHET）降解为 TPA 单体），限制了其实际应用。
为解决 PET 酶法再生的瓶颈，天津大学研究团队通过静电相互作用提升 IsPETase 热稳定性，得到了热稳定性显著提升的突变体，大幅提高了 PET 降解活性和 MHETase 活性。
通过降解高结晶度 PET 得到了单一的对苯二甲酸（Terephthalic acid，TPA）产物，可进一步利用 TPA 合成新料级 Rebirth-PET（Rb-PET）聚酯。
近日，相关论文以《基于静电相互作用策略提升 IsPETase 的 PET 和 MHET 降解活性》（Enhancement of the polyethylene terephthalate and mono-（2-hydroxyethyl）terephthalate degradation activity of Ideonella sakaiensis PETase by an electrostatic interaction-based strategy）为题发表在 Bioresource Technology 上[1]。
天津大学酶工程与技术课题组博士生殷庆典、尤生萍副研究员和博士生张嘉兴为该论文共同第一作者，齐崴教授为通讯作者。
设计 PET 回收新途径
目前，对于 PET 塑料进行生物法处理有两个思路。一种方法是利用特殊的微生物或酶，将原本自然界中 PET 塑料的降解速度大幅度提升。利用这种方法可使 PET 塑料降解为对环境无害的物质，最终回归自然。
另一种方法是，通过回收站将 PET 废塑料（如 PET 塑料瓶等）从消费商家、消费者和环境中回收起来，经过酶法再生，获得新料 PET，进而循环再利用。
该团队利用第二种思路，通过设计特异且高效的酶，能够将 PET 塑料催化降解为 TPA 和乙二醇（ethylene glycol，EG），而 TPA 和 EG 又是合成新料级 PET 的原料，有望真正实现 PET 的循环再生。
尤生萍说：“这是高品质的循环再生，可完全打通 PET 的‘消费-回收-再生-消费’循环，创造新的 PET 回收途径，有望让 PET 产业真正实现资源的闭环。”
该团队提出了一种通过静电相互作用提升 IsPETase 热稳定性的策略，主要基于蛋白质稳定性的结构分析。
根据已经有文章报道，IsPETase 的 β6-β7 连接环 (Asp157-Phe162) 具有较高的 B 因子值（22.2），是整体结构中波动最大的区域之一，而与其同源的 PET 酶 TfCUT2 的环区 His156-Trp161 结构却比较稳定。
尤生萍解释道：“这是因为 His156 残基与 Asp94 残基形成氢键，有助于提升环区的稳定性，而 IsPETase 的保守位点 Asp157 与 Ser92 之间缺乏有效的相互作用。”
基于此，团队设计了在 Ser92 和 Asp157 之间构建静电相互作用的方法，通过盐桥的引入，调控生成多种IsPETase 突变体，借助静电相互作用来增加 β6-β7 连接环的稳定性。
首先，研究团队找到影响 IsPETase 稳定性的柔性区域，对 IsPETase 进行结构分析。以负电 D157 残基作为切入点，引入盐桥，调控并增强二级结构间的相互作用，进而实现强化蛋白结构、增强热稳定性的作用。
尤生萍表示：“我们得到了热稳定性显著提升的突变体 IsPETaseS92K/D157E/R251A，大幅提高了 PET 降解活性和 MHETase 活性，并通过降解高结晶度 PET 得到了单一 TPA 产物。”
该研究中构建的 IsPETaseS92K/R251A 突变体和 IsPETaseI139R 突变体的 Tm 值大幅提升（53.08℃ 和 56.37℃），具备更高的热稳定性。增强的热稳定性使得酶能够更长时间地维持其降解活性，表现出降解效率的提升。
IsPETaseS92K/R251A 突变体在 30 ℃降解高结晶度 PET 膜（hcPET）的效率达到野生型的 2.5 倍，而具有更高 Tm 值的 IsPETaseI139R 突变体在 40℃ 降解 hcPET 的效果达到野生型的 3.6 倍。
另一方面，IsPETaseS92K/D157E/R251A 突变体不仅大幅提升 Tm 值，达到 52.75℃，而且该突变体降解 hcPET 得到了单一的对 TPA 产物。
进一步通过实验和分子动力学模拟，验证了 IsPETaseS92K/D157E/R251A 突变体对降解 MHET 底物的活性提升。通过酶促降解，可直接得到 TPA，有利于进一步的产物回收，用于循环制造 PET 或进一步转化为高值产品。
酶蛋白微观结构精准调控与三级结构 AI 重组技术
天津大学酶工程与技术课题组以产品开发为导向，主要开展酶结构模拟分析/AI 定向改造、高效异源表达、发酵动力学建模/过程模拟等基础性研究，以及生物催化工艺过程强化等应用基础研究，贯穿生物技术上、中、下游，并从分子、细胞和反应器三个层次对酶制剂的制备过程进行了系统研究。
为解决天然酶活性低及稳定性差难以实际应用的瓶颈问题，该团队基于酶结构建模和构效关系分析，通过理性设计与定向改造，实现了酶蛋白微观结构的精准调控，从而提升酶制剂的性能。
他们研究了酶关键残基位点的遴选策略与迭代改造模式，建立了稳定酶活性口袋的调控机制，可根据不同酶的性能需求进行精准改造提升。在已有的酶改造实例中，采用静电相互作用、环区功能强化、金属离子调控与二硫键设计等方法，显著提升了 17β-HSD3 酶、β-甘露聚糖酶、漆酶和 IsPETase 酶等多种酶的活性和热稳定性。
例如，该团队全面解析了 17β-羟基类固醇脱氢酶 3（17β-HSD3 酶）的结构特征和催化机理，并以此为基础开展酶的理性设计与改造：在确定活性口袋中关键氨基酸残基的基础上，调整其疏水性和极性，获得了催化活性显著提高的 G186R/Y915W 突变酶。
分子动力学模拟表明：突变酶与底物之间的静电相互作用和形成的氢键，增强了突变酶对底物的亲和力，从而提升了突变酶的催化活性，使得高效表达 G186R/Y915W 突变酶的毕赤酵母工程菌催化 4-AD 产睾酮的产量达到 3.98 g/L，比初始重组菌的睾酮产量提高 1.97 倍[2]。
此外，针对 β-甘露聚糖酶在实际应用中环境温度为 60-80℃ 条件下热稳定性差的问题，通过模拟退火方法确定了对 β-甘露聚糖酶的活性具有较大影响的关键氨基酸残基，并预测了能够提升其热稳定性的 A336P 突变，所得酶突变体活性提高了 77%，酶活半衰期提高了 24 倍，大幅提升了该酶的活性/热稳定性[3]。
已开发的酶微结构精准调控策略存在一定局限性，表现为对于某些天然酶类其活性或热稳定性提升幅度有限，难于实现产业化应用。
为解决该问题，该团队建立机器学习的模型与算法，对酶的三级结构进行重构优化，获得自主拆解的酶二级结构数据库与三级结构重构的酶组装体文库。通过高通量筛选和迭代进化，获得高性能酶组装体，并形成酶蛋白改造的通用技术。比如，通过对 PET 降解酶 38 个酶组装体文库进行高通量筛选并迭代进化，获得高性能酶组装体。
在 40℃ 下，相比于野生酶，PET 酶组装体的活性提高了 500 倍，Tm 值从 46℃ 提高至 71℃，大幅提升了 PET 瓶的酶解效率，已获得公斤级 99% 纯度的 TPA 样品，可进一步利用 TPA 合成新料级 Rebirth-PET（Rb-PET）聚酯。
“通过晶体结构解析明晰塑料降解酶作用的分子机制，进一步通过酶工程技术实现酶催化效率和稳定性的提升，将不断拓宽该领域的研究，进而推动工业应用。”尤生萍说。
未来要实现相关生物技术的产业化应用，应加强与化学工程、材料科学等学科的交叉研究。随着科学技术的不断突破，生物处理方法有望成为 PET 塑料废弃物回收处置的重要手段，解决 PET 塑料的“白色污染问题”。
参考资料：
1.Qingdian Yin,Shengping You,JiaxingZhang et al. Bioresource Technology 364, 128026（2022）. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.128026
2.Juanjuan Ding,Shengping You,JiaxingZhang et al. Bioresource Technology 341，125833 (2021). https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125833
3.Xiang-ChaoWang,Sheng-PingYou,Jia-XingZhang et al. Enzyme and Microbial Technology 118，50–56 (2018) . https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2018.07.005