十大变革科技｜打开微观生物世界的大门：超分辨显微成像技术

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榜单11月20日正式发布！

下文是上榜科技——“超分辨率显微成像”的前沿技术解读。

随着生命科学的发展，对于微观世界的表征越来越重要但是大部分的微观表征技术需要破坏细胞结构，无法完成原位直接观测。同时，传统的显微成像技术受制于衍射极限的问题，光学分辨率一直被限制在200-300nm，因此我们迫切需要研发一种高分辨的显微成像技术。目前较成熟的超分辨显微成像技术有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)；以及通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED) 技术。总体而言，超分辨显微成像成功突破了人类观察微观生物世界的光学衍射极限，为人们探索微观生命世界提供了新的帮助。

随着生命科学的发展，转录组学、基因组学、蛋白质组学等先进的组学手段使我们对于细胞的组成、代谢等生命活动有了更深刻的认识。但是细胞中的蛋白质与核酸不是随机分布的，它们很少孤立的在细胞内发挥其生理作用，必须在合适的位置与合适的生物分子结合在一起形成复合物才能完全的发挥其生理作用。在这个过程中，存在着无数的分子间或分子内的相互作用，从而完成对于生物体的精确调控。在组学分析过程中，胞内物质被打乱成碎片从而完成测序与分析，这无法精确地刻画蛋白质和核酸的动态时空互作。因此，我们需要高精度的直观成像技术。

图1 罗伯特·虎克使用过的显微镜（a）

列文虎克绘制的白蜡树显微切片（b）

图源：Wiki百科

长期以来，显微镜尤其是光学显微镜一直被认为是生物研究中不可或缺的工具。自1665年罗伯特·胡克用显微镜发现了细胞以来，从进化论的诞生到研究细胞的分子结构，显微成像技术支撑了生物学中许多关键性的突破。然而由于衍射效应，光学显微镜的空间分辨率一直限制在200-300nm。但是在生物研究中，两个神经元的突触间隙是20nm，形成染色质重复单元的核小体只有10nm。因此迫切需要更高分辨率的显微技术。

近年来，随着新型探针分子的合成以及先进成像理论的出现，研究者开发出多种超出传统共聚焦显微镜分辨率极限的成像方法，我们称之超分辨率显微成像技术（super-revolution microscopy imagination）。较成熟的有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)。以及通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率受激发射损耗显微技术(STED)技术。

当显微镜的物镜视野中存在两个以及两个以上需要分辨的点光源时，此时分辨率会受到光学分辨率的极限的限制，难以实现对不同光源的精确定位。当物镜视野中有仅有单个荧光分子形成的点光源时，通过特定的算法拟合，该荧光分子位置的精度可以突破光学分辨率的极限。

然而，上述方法所提高的仅是单分子的定位精度，在面对提升多个点光源的分辨率这一重大问题面前显得无能为力。2005年，德国科学家Betzig等发现了光激活荧光蛋白(PA-GFP)，为提升多个点光源的分辨率这一难题带来了新的思路：PA-GFP是一种来自Aequorea victoria水母的绿色荧光蛋白突变体，在稳定状态时，普通绿色荧光蛋白（GFP）仅在395nm和475nm处分别有一大一小两个吸收峰，在504nm处并无明显吸收；然而，突变为PA-GFP的绿色荧光蛋白在504nm处的最大光吸收约为GFP的100倍，在488nm激发下发射荧光的强度比GFP增加了大约3倍；结合PA-GFP这种特殊发光特性和单分子荧光成像高定位精度的特点，人们终于找到了解决光学显微镜分辨率极限这一重大科学问题的突破口。

随后，在2006年，Betzig等首次在Science上提出了PALM的概念。其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，使用波长为405 nm 的低能量激光照射细胞表面，一次仅激活少数几个荧光分子，之后用488nm激光照射，通过特定的算法拟合来精确定位这些荧光单分子。待精确定位以上分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已定位的荧光分子，使其不能够被下一轮的激光再激活出来；在重复以上过程上百次后，他们终于将细胞内所有荧光分子精确定位，将精确定位的分子的图像合成到一张图上，便得到了一张比传统光学显微镜分辨率高数倍以上的超分辨率显微图像。

图2 PALM法成像原理示意图[3] 

(图源：Science, 2006, 313: 1642-1645.)

PALM成像方法的发明是超分辨率显微成像方法的重大里程碑，然而，PALM只能用来观察外源表达的蛋白质，对于细胞内源蛋白质的定位无能为力。

无独有偶，在PALM技术问世的2006年，另一种超分辨率显微成像技术——STORM也由庄小威团队开发并成功问世。相较于PALM所使用的的荧光蛋白点光源，STORM所使用的是有机荧光分子染料，利用荧光染料来标记抗体，对靶蛋白进行识别，这样便可以实现内源性蛋白的检测，并避免外源性表达的偶联荧光蛋白对特定蛋白定位产生的影响。当使用很弱的光来激发荧光分子时，细胞内仅会有很少一部分的荧光分子受激发光，当这样的点光源在物镜下稀疏分布时，可认为光源之间没有发生重叠，即可将每个点光源近似为一个荧光分子。在单次激发中，可以确定一部分光晕的中心；在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕的中心，把这许多次激发的结果叠加，就是完整而清晰的图像。

由于消除了光漂白步骤，相较于PALM，STORM可以更快地采集数据。然而，STORM的实现依赖于高效的荧光染料：不仅要求染料产生的光信号足够强，且还好具有良好的闪烁密度。闪烁太快或太慢都会造成成像质量的下降。因此，当前STORM的技术革新主要集中在开发新型的荧光染料上。初代STORM使用的染料是花青素荧光染料，如cy3、cy5等，目前，STROM技术中使用的多是罗丹明衍生物远红外染料，如Alexa fluor 647、CF583R、CF597等。

图3 STORM成像与传统光学成像的分辨率差距

（A、C、E为传统光学成像，B、D、F为STORM成像）[4]

（图源： Nature Methods, 2006, 3: 793-795.）

STED提升分辨率的原理与PALM和STORM截然不同，在介绍STED的成像原理之前，我们有必要回顾一些光学显微镜的成像理论：

由于衍射极限的存在，显微成像系统的照明光只能在样品上形成有限小的圆形光斑，被称作艾里斑（Airy disk），光学显微镜的分辨率决定于光学系统中艾里斑的尺寸。此外，当一个艾里斑的边缘与另一个艾里斑的中心正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被人眼或光学仪器所分辨。

减小艾里斑的尺寸是提高显微镜分辨率的一条重要策略，德国科学家Hell等在1994年创造性地利用受激辐射来抑制自发荧光辐射：在成像前，先利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态，随后，使用与激发光共轴的，中心光强为0的环状损耗光照射样品，此时，处于激发光斑外围的激发态分子将以受激辐射的方式释放能量，进而回到基态，只有处于纳米级环形淬灭激光中心处的荧光分子才能正常发光，通过扫描的办法就可以得到超越衍射极限的光学成像。继续以自发荧光的方式回到基态。通过激发光-损耗光限域组合的照明方式，将荧光发射区域限制在一个远小于艾里斑的区域内，从而获得一系列突破了衍射极限的荧光发光点。之后，通过扫描共轴的激发光与损耗光，获得一幅超分辨图像。

相较于PALM和STORM，STED的技术关键主要集中在实现高效荧光控制而非开发新型荧光物种上。尽管STED为实现荧光控制，需要损耗较高的光强度,但免除了后续的拟合处理。

图4 STED方法与PALM、STORM的不同之处[7]

（图源：Journal of neurochemistry, 2013, 126: 23-212.）

超分辨显微成像成功“越过”了人类观察微观生物世界的光学衍射极限，凭借其超高的空间分辨率和时间分辨率，将分子层面的生命体的运动呈现在科学家面前，而不会造成对生命体的伤害，实现超高分辨的动态成像。这一技术在探究细胞结构的空间分布和分子相互作用、生物分子复合体计量学、细胞结构动态学等方面有着重要的应用，还可以用于研究神经细胞、蛋白复合体等特定分子的组装，这将为生物学研究带来重大突破。

然而，挑战仍然存在。尽管理论空间分辨率并无限制，但是在实际的生物体成像过程中，受诸多因素的影响，空间分辨率通常在10-70nm之间，依然无法实现真正的分子级观测（1nm）。而超高的时间分辨率和空间分辨率往往是难以兼得的，目前的时间分辨率仅可以在某些情况下达到毫秒量级，在用于观察更快的变化过程时会受到限制。而且，由于光毒性，生物样品不能被长时间照射，进一步限制了动态观察的窗口。因此，能够深入观测细胞内部分子结构的活体超高分辨显微成像技术将成为下一步的研究热点。如果能够进一步提高时空分辨率，同时实现多分子样品的同时观测与成像，将为人们从分子层面理解生命带来新的机遇。

参考文献及链接：

[1]Antonie van Leeuwenhoek [EB/OL] https://wikipediaglobal.org/wiki/Antonie_van_Leeuwenhoek

[2]Valli, J., Garcia-Burgos, A., Rooney, L.M., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique [J]. Journal of Biological Chemistry, 2021, 297(1), 100791.

[3]Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution [J]. Science, 2006, 313(5793): 1642-5.

[5]Rust M J, Bates M, Zhuang X W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) [J]. Nature Methods, 2006, 3(10): 793-5.

[4]BATES M, HUANG B, DEMPSEY G T, et al. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes [J]. Science, 2007, 317(5845): 1749-53.

[6]Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated-emission - stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy [J]. Optics Letters, 1994, 19(11): 780-2

[7]EGGELING C, WILLIG K I, BARRANTES F J. STED microscopy of living cells - new frontiers in membrane and neurobiology [J]. Journal of Neurochemistry, 2013, 126(2): 203-12.

[8]专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术[EB/OL] https://ibook.antpedia.com/x/469350.html

[9]Sigal, Y.M., R. Zhou, and X. Zhuang, Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy [J]. Science, 2018. 361(6405): p. 880-887.

作者 |李可扬 赵树南 邵文洁

排版 |龙吟 王昕阳

审核 |傅宇杰 陈星安 许鹤麟 程泽堃