*仅供医学专业人士阅读参考
肺腺癌（LUAD）作为诊断频率最高的肺癌亚型，常常在早期筛查时就可确诊。然而，早期LUAD的术后5年生存率仍低于50%，如发生远处转移，患者5年生存率不足7%[1]。因此，借助高通量测序技术提供更多的药物研发靶点和预测预后的生物标志物，进一步提高早期LUAD患者生存率，是目前效率较高的研究策略。
近日，德克萨斯大学MD安德森癌症中心的王淩华团队和Humam Kadara团队在Cancer Discovery 上发表了有关早期LUAD单细胞测序的重要研究成果。
他们发现早期LUAD肿瘤组织中浸润大量的B细胞和浆细胞（TIB），并深入揭示了TIB在肿瘤进展中表型的变化，同时结合公共数据库，确证TIB浸润丰度可预测早期LUAD患者免疫治疗疗效和生存预后，而后在转录组水平分析不同TIB亚群的差异基因，绘制了可用于后续开发TIB 靶向免疫疗法的路线图。
论文首页截图
现有研究显示，TIB的浸润差异在很大程度上影响了LUAD患者化疗和免疫治疗的疗效以及生存预后，但限于目前研究样本中TIB数量较少，无法对LUAD的TIB浸润差异进行深度的细胞表型和分化程度分析[2]。为全面揭示早期LUAD中浸润的TIB表型特征，探明TIB在LUAD免疫微环境中的真实身份，研究团队展开了以下探索[3]。
研究团队收集了16例早期LUAD患者的肿瘤组织，依据患者吸烟习惯分为吸烟组7例和不吸烟组9例；参照距肿瘤远近（邻近、居中、远处）多点取样47组癌旁组织。所有组织样本在完成单细胞解离后进行转录组测序（scRNA-sq）和B细胞受体测序（scBCR-sq），根据测序结果注释出样本中的B细胞和浆细胞，整合样本细胞数据集后完成表型分析和亚群鉴定。
研究设计流程图
通过初步亚群注释，研究人员得到了目前细胞数量最多的早期LUAD相关TIB单细胞数据集，该数据集包含49,062 个TIBs，分为12个TIB亚群。相较于癌旁组，TIBs在早期LUAD肿瘤组织中大量浸润，其中吸烟组样本中浆细胞浸润程度更高。
早期LUAD组织B细胞分布UMAP图，根据B细胞转录谱分群(左)；根据B细胞抗体表型scBCR-seq数据分群(右上)；根据样本组取材位置(右中)和患者吸烟状态对应B细胞分群(右下)。
借助已发表的肺癌数据集[4-6]和TCGA LUAD数据库[7]，研究人员进一步证实了早期LUAD患者中吸烟人群有更显著的浆细胞浸润，患者临床信息分析显示，浆细胞的大量浸润并非坏事，LUAD肿瘤组织中浆细胞含量较高的患者对免疫治疗更加敏感，且预后更好。
显然，根据早期LUAD患者肿瘤组织中浆细胞的浸润程度可以预测免疫治疗疗效及预后情况，因此研究人员深入细化了浆细胞的差异化状态，进一步锁定浆细胞这个“预言家”。
单细胞分化轨迹分析表明，浆细胞在浸润过程中存在三种细胞状态，分别为：短寿浆细胞，长寿浆细胞，以及浆母细胞（PB）。相较于不吸烟的患者，长寿浆细胞在早期LUAD吸烟人群中显著浸润。此外，相较于癌旁组织，肿瘤组织中IgA1/IgA2+ 浆细胞浸润丰度更高。
不同组织类型中B细胞和浆细胞亚型浸润差异
记忆B细胞的产生与上述长短寿浆细胞分化同步进行，研究人员分析整合了不同样本组织的scBCR-seq数据。分析结果显示，早期LUAD肿瘤组织中浸润较多的记忆B细胞显著高表达IgA与IgG，大部分产生于生发中心的晚期阶段，相较于癌旁组织，早期LUAD肿瘤组织中B细胞的BCR克隆多样性更丰富。
细胞分化轨迹分析显示记忆B细胞分化过程中有超过3000个可变基因，通过上游同型克隆之间BCR序列的重叠分析，研究人员发现早期LUAD肿瘤组织中的B细胞表面有着更频繁的Ig转换（在IgG3，IgG1，IgA1，IgG2，IgG4 和IgA2之间），并且可能发生了独特的V(D)J重排。
在scBCR-seq的基础上，研究人员进一步量化了B细胞的体细胞高突变（SHM）水平，将早期LUAD组织中浸润的B细胞分为无SHM组，低SHM组（突变频率≤3%），和高SHM组（突变频率＞3%），再结合B细胞克隆，样本取材位置和BCR表型分析发现，细胞距离肿瘤中心越近，细胞克隆越大，发生体细胞突变的频率越高。
B细胞SHM分组及差异分析
作为免疫细胞的TIB，主要聚集于CXCL13表达较高的淋巴细胞“根据地”，而这个CXCL13+根据地成员，也就是对应的免疫细胞，会随着 LUAD 进展而更新换代，例如 CD4 调节性 T 细比例发生上调，CXCR5+的B细胞也会通过CXCR5-CXCL13轴募集CXCL13+的免疫细胞（以滤泡辅助T细胞、调节性T细胞、CD8耗竭型T细胞，成纤维细胞和巨噬细胞为主）。
结合研究团队前期发表的癌前组织RNA-seq数据[8]，随着肺组织恶性程度的加重（正常→非典型腺瘤→早期LUAD），CXCL13的表达水平和TIB的浸润也逐渐升高，此种同步升高的现象也进一步说明CXCR5-CXCL13轴在早期LUAD的形成过程中发挥了一定的促癌作用。
最后，通过分析免疫调节基因表达差异，研究人员明确了，与LUAD中IgA+浆细胞浸润程度较高有关的调控基因TGFB1（该基因主要在成纤维细胞中高表达）。另外，研究人员发现，多个免疫抑制性细胞的浸润与记忆B细胞和PC浸润程度呈负相关，但具体的调控机制和信号通路有待后人探索。
总之，该研究不仅为早期LUAD单细胞数据库贡献了详实的转录组和B细胞组学数据，同时也结合已发表数据集，阐明了LUAD进展过程中TIB的表型演变和免疫调控作用，层层剖析，抽丝剥茧，从表面抗原，到克隆突变，再到差异基因，全面细化了早期LUAD肿瘤微环境的B细胞构成和调度机制，为新型免疫治疗的研发和患者预后预测提供了新的关注点，也为后续的B细胞免疫调控机制研究留下一座宝矿。
参考文献：
1. Goldstraw, P., et al., Non-small-cell lung cancer. Lancet, 2011. 378(9804): p. 1727-40.
2. Helmink, B.A., et al., B cells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapy response. Nature, 2020. 577(7791): p. 549-555.
3. Hao, D., et al., The Single-Cell Immunogenomic Landscape of B and Plasma Cells in Early-Stage Lung Adenocarcinoma. Cancer Discov, 2022.
4. Fehrenbacher, L., et al., Atezolizumab versus docetaxel for patients with previously treated non-small-cell lung cancer (POPLAR): a multicentre, open-label, phase 2 randomised controlled trial. Lancet, 2016. 387(10030): p. 1837-46.
5. Prat, A., et al., Immune-Related Gene Expression Profiling After PD-1 Blockade in Non-Small Cell Lung Carcinoma, Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, and Melanoma. Cancer Res, 2017. 77(13): p. 3540-3550.
6. Rittmeyer, A., et al., Atezolizumab versus docetaxel in patients with previously treated non-small-cell lung cancer (OAK): a phase 3, open-label, multicentre randomised controlled trial. Lancet, 2017. 389(10066): p. 255-265.
7. Campbell, J.D., et al., Distinct patterns of somatic genome alterations in lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas. Nat Genet, 2016. 48(6): p. 607-16.
8. Sivakumar, S., et al., Genomic Landscape of Atypical Adenomatous Hyperplasia Reveals Divergent Modes to Lung Adenocarcinoma. Cancer Res, 2017. 77(22): p. 6119-6130.
责任编辑丨张金旭