同样是研究基因编辑，武汉大学医学研究院教授张楹的经历略有不同。在美国科罗拉多大学和哈佛大学，分别读完博士和完成博士后训练之后，她加入诺奖得主埃玛纽埃勒·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）创办的基因编辑初创公司CRISPR Therapeutics，如今该公司已是市值 50 亿美元的上市企业。
当时，作为公司第一个研究员，她参与了团队组建和首个管线的临床前研究。通过三年努力，她和同事构建了基因编辑和产品开发的平台。
基于此，其又与团队完成了地中海贫血症项目，所参与研发的通过基因编辑造血干细胞来治疗地中海贫血症的细胞产品，已经完成临床三期实验，并于近期提交了新药批准申请。
研发中，她发现当前的基因编辑工具虽能治疗一些遗传疾病，但是面对大多遗传疾病来说，依然受限于技术本身。
基于此，她萌生了回国组建团队的想法，希望从解决临床转化问题出发，通过研发新型基因编辑工具，为多疾病的解决带来新希望。
自 2018 年回国至今，已有 4 年时间，期间她还入选了湖北省科技创新百人计划。而在不久前，她和团队在 Molecular Cell 发了一篇新论文，揭示了基因组编辑工具 PAM-Cas9 的互作新机制，也提出了 DNA 构象可以直接影响基因编辑效率的新理论。
评审专家认为这是一项激动人心的研究，所发现的首个天然具备广谱 PAM、且高活力的 Cas9 蛋白，照亮了 Cas9 和 PAM 互作的新方向，为研发不依赖 PAM 序列的精简型基因编辑工具带来了新路径。
AtCas9：一种高保真的基因编辑酶
据介绍，CRISPR/Cas9 基因编辑系统已成为强有力的基因编辑工具，在基础研究和临床转化中展现出无穷潜力。
CRISPR/Cas9 系统主要由 Cas9 蛋白和 gRNA 组成。gRNA 提供序列特异性，靶向与之配对的 DNA 序列，从而为 Cas9 核酸酶提供精准定位、并最终切割 DNA，进而实现基因编辑。
除了 gRNA 提供序列特异性之外，CRISPR/Cas9 在行使编辑功能时，还依赖于识别靶标 DNA 上的特殊序列（PAM，protospacer adjacent motif）。
关于 AtCas9 和 PAM 的关系，研究团队用一幅“洛神琵琶舞图”做了形象的说明。
如下图，洛神就是 AtCas9, 琵琶则是 PAM，彩带是双链 DNA。当彩带紧密缠绕时，洛神借助琵琶在彩带中起舞；当彩带松散缠绕时，洛神无需琵琶就能自由飞舞。
据介绍，PAM 序列的复杂程度决定了可编辑位点的上限。在实际应用中，常常因为靶位点没有 PAM 序列，导致 Cas9 无法靶向、进而阻碍了基因编辑的有效性。
而不同细菌来源的 Cas9 蛋白，其 PAM 序列也不同。利用这一特征，该团队从微生物出发，通过大量的筛选，最终从嗜热菌中筛选出一个天然具有广谱 PAM 且高活力的 Cas9 蛋白，简称 AtCas9。
通过一系列生化实验，课题组发现 AtCas9 的 PAM 序列为 CNNN 和 RNNA（R=A 或 G）, 可以覆盖～68% 的基因组序列，而最常用的 SpCas9 的覆盖率仅为大约 12.5%。
这意味着，该发现显著提高了可编辑基因位点的范围，提高了基因治疗的可行性。虽然是嗜热菌来源，但是 AtCas9 在哺乳动物的内源性基因位点，也具有高效的基因编辑活力。
以 AtCas9 为基础的胞嘧啶单碱基编辑器（AtCas9-BE3），最高编辑效率达 72%，在多个基因组位点平均编辑效率达 30.91%。
同样的，腺嘌呤单碱基编辑器（AtCas9-ABE8e）也可在内源性基因位点发挥功能，平均编辑效率为 16.72%。
研究中，课题组对新型 AtCas9 编辑器做了进一步的脱靶分析。结果显示，相比目前应用最广泛的 SpCas9，AtCas9 并没有检测到脱靶现象，这说明 AtCas9 是一种高保真的基因编辑酶。
并且，当 DNA 处于特殊的拓扑结构时，AtCas9 可以不依赖 PAM 进行高效编辑，在细菌中无需依赖 PAM 序列，就能高效地切割质粒。
为了探索 AtCas9 摆脱 PAM 限制、并对 DNA 进行高效编辑的原理。研究团队通过生化实验和结构预测，解析了 AtCas9 和 DNA 互作的新机制。
和已发现的互作机制相比，AtCas9 除能通过经典氢键相互作用力、以及空间位阻排斥力之外。其所包含的一段特殊结构，可以像“钥匙”一样嵌入含有“锁”结构的 DNA 中。
当 DNA 结构改变时，“锁”的形状发现改变，使得和钥匙结合更加紧密，最终实现不依赖 PAM 就能进行高效的基因编辑。
对这一全新机制进行解析后，课题组发现：除了 DNA 序列会影响基因编辑效率，DNA 的构象也会影响最终的编辑效果。
近日，相关论文以《DNA 拓扑结构调节 PAM-Cas9 相互作用和 DNA 解旋，以实现嗜热 Cas9 近乎无 PAM 的切割》（DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9）为题发在 Molecular Cell（IF 19.3）上，武汉大学医学研究院博士研究生史亚晶、段敏以及云南师范大学丁俊美是共同一作，张楹担任通讯作者。
提出“一墙假说”
就研究步骤来说，课题组先从极端环境微生物入手，通过生物信息学的分析，筛选除了具备完整 CRISPR-Cas 系统的新型 Cas 蛋白，并在实验中鉴定其 PAM 序列。
令人惊讶的是，AtCas9 并没有明显的 PAM 序列偏好。确定 AtCas9 在大肠杆菌体内不能发挥功能之后，他们在体外使用不同的酶，来处理 PAM 文库质粒，使其变为不同的 DNA 构象，借此来验证 PAM 序列。
结果发现这与大肠杆菌体内的一致，即在体外 PAM 文库筛选中，AtCas9 对于超螺旋质粒，并未表现出 PAM 偏好。
但是，当 PAM 文库处于线性、或开环构象时，则能展现出对于第 5 位 C/A/G 的偏好。查阅文献之后，课题组并未发现 DNA 结构可以直接影响 PAM 序列的任何报道。
这一特殊现象激发了他们继续研究的动力。在表征现象的过程中，研究团队利用生化手段，鉴定了可以正调控、或负调控 PAM 识别的 DNA 构象。
为了挖掘背后的机制，其构建了几十个蛋白突变体，提出大量假说和设想去解释这一特殊现象。
然而，没有一个假说可以全面地解释所有数据。而在揭示 Cas9-PAM 互相作用的现有报道里，都是通过结构解析实现的。
于是，他们开始利用 AlphaFold2 和 SWISS 模型，去分别预测 AtCas9 的结构，两个模型预测出来的结果高度一致。接着，研究团队又通过生化实验验证这一预测结果，最终揭示了基因组编辑工具的新机制。
“值得指出的是，此次发现离不开多位同学的奋力拼搏。史亚晶外号‘绣娘’，心灵手巧的她完了所有生化实验和真核编辑；段敏，自学 AlphaFold，完成了关键结构的预测；同时，也衷心感谢实验室每位同学的付出。”张楹表示。
AtCas9：进一步拓宽基因组编辑的范围
在应用前景上，AtCas9 可识别的 PAM 为 CNNN 和 RNNA，可以覆盖大约 68% 的基因组序列。而目前应用最广泛的 SpCas9，仅覆盖 12.5% 左右的序列。可以说，AtCas9 进一步拓宽了基因组编辑的范围。
因此，可将 AtCas9 与不同的蛋白进行融合，可用于不同的方向。例如，通过融合不同脱氨酶形成单碱基编辑器、通过融合逆转录酶改造成先导编辑器系统以实现大片段的插入或缺失、也可通过融合转录激活子或抑制子来启动或抑制基因转录、以及通过融合荧光蛋白来对基因组进行成像等。
也就是说，AtCas9 不仅能作为一款科研工具，还可以成为基因治疗的工具，从而用于临床遗传性疾病的细胞治疗。
同时，对于不同拓扑结构的 DNA，AtCas9 也可以进行识别，故可将 AtCas9 作为 DNA 构象的传感器，去探索 DNA 构象对细胞功能的影响。
概括来说，基于此次工作他们发现，AtCas9 可以在松弛 DNA 构象中实现近乎无 PAM 的切割。体外生化实验显示，这是由于 AtCas9 独特的 PAM 识别方式、以及 DNA 拓扑结构调节共同作用的结果。
接下来，课题组将通过分析蛋白结构和单分子实验，更加细致地研究 AtCas9，以挖掘其分子机制，从而为相关应用打下理论基础。
另外，还可根据结构信息对蛋白进行改造，结合细菌定向进化、提高其在真核细胞的基因编辑活力，进而拓展其应用前景。
同时，研究团队还打算让 AtCas9 成为一种可以识别不同 DNA 构象的构象传感器，借此建立一种全新的、可表征细胞内 DNA 拓扑结构动态变化的新工具。
参考资料：
1.Shi, Y. J., Duan, M., Ding, J. M., Wang, F. Q., Bi, L. L., Zhang, C. X., ... & Zhang, Y. (2022). DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9. Molecular Cell, 82(21), 4160-4175.