*仅供医学专业人士阅读参考
免疫检查点抑制剂通过激活机体自身的抗肿瘤免疫反应，为癌症治疗带来新的选择。然而凡事皆有两面性，免疫检查点抑制剂在增强抗肿瘤免疫反应的同时，也会打破机体自身的免疫稳态，进而导致各种器官系统的自身免疫反应。
虽然这些不良反应大多可以通过激素治疗来控制，但免疫检查点抑制剂引起的心肌炎（ICI-MC）可导致严重的心律失常，死亡率高达50%[1-3]。此外，目前临床上可用于预测免疫检查点抑制剂疗效和毒性的生物标志物有限，对于这些不良反应产生机制的理解也不是十分清楚。
近日，来自美国范德比尔特大学医学中心的Justin M. Balko和Javid J. Moslehi团队在《自然》期刊发表重要研究成果，他们发现识别α-肌球蛋白的自身反应性T细胞在ICI-MC发病中有着关键作用，这一发现对于预防、诊断和治疗ICI-MC有着重要意义[4]。
论文首页截图
先前的研究表明，在ICI-MC患者的心脏和骨骼肌中都存在高频率的T细胞克隆，这提示肌肉中可能存在共同的靶抗原，驱动着T细胞的激活与扩增[5, 6]。搞清楚这些抗原是什么，对于理解ICI-MC的机制有着重要意义。
由于从临床上收集心肌组织样本十分困难，研究人员构建了一种Pdcd1基因纯合敲除且Ctla4基因杂合缺失（Pdcd1-/-Ctla4+/–）的小鼠来模拟ICI-MC[5]。这种小鼠可以发生暴发性心肌炎，与ICI-MC有着相似的临床和病理特征。
a. Pdcd1和Ctla4基因缺失小鼠的表型总结：Pdcd1-/-Ctla4+/+小鼠无明显表型。不管Pdcd1基因型如何，Ctla4完全缺失的小鼠会发生致命的淋巴增生性疾病。Pdcd1-/-Ctla4+/-小鼠发生暴发性心肌炎。b. 健康野生型小鼠和患有心肌炎的Pdcd1-/-Ctla4+/-小鼠的心脏组织H&E染色。
接着，研究人员通过单细胞RNA和TCR测序分析Pdcd1–/–Ctla4+/–心肌炎小鼠和健康野生型小鼠心脏浸润的免疫细胞。和预期一致的是，两种小鼠心脏浸润的免疫细胞有着明显差异。其中最为显著的是，心肌炎小鼠中检测到了一大群活化的T细胞，而对照小鼠的T细胞更多为初始状态。
研究人员对T细胞单独进行了更加深入的分析。结果发现，和正常小鼠相比，心肌炎小鼠中有大量活化的效应CD8+T细胞。通过对单细胞TCR测序的数据分析发现，正常小鼠中未鉴定出克隆性T细胞（指＞2个细胞具有相同TCR克隆型），相比之下，心肌炎小鼠样本中63%的T细胞表现出克隆性TCR。这些结果表明心肌炎小鼠的组织中浸润了大量活化的、且发生了克隆扩增的CD8+T细胞。
那么这些CD8+细胞聚集在这里起到了什么作用呢？研究人员发现，通过抗体清除Pdcd1–/–Ctla4+/–小鼠的CD8+细胞，可以显著延长小鼠的生存期，然而清除CD4+细胞则没有这一作用。类似地，将Pdcd1–/–Ctla4+/–心肌炎小鼠的脾脏细胞过继转移到Rag1–/–小鼠（缺少成熟的T、B细胞）中，也可以诱导致命性心肌炎，但如果转移清除过CD8+细胞的脾细胞则不能。
清除CD8+细胞可有效避免小鼠因心肌炎导致的死亡。
此外，研究人员在这些发生了心肌炎的小鼠中也检测到了TCR强烈的单克隆扩增，那么这些TCR究竟识别了什么抗原呢？
通过分析前面的数据，研究人员选择了7个主要的TCRs进行了研究。他们在带有NFAT-GFP报告基因（用来指示T细胞活化信号）的人源T细胞系中表达这些TCRs[7]，并将同源的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）作为抗原呈递细胞。
有了合适的筛选体系，接下来就是挑选潜在的自身抗原用于验证了。
通过对人的胸腺抗原呈递细胞RNA测序数据进行分析[8]，研究人员发现有4个心脏高表达的基因在胸腺中没有检测到表达（MYH6，NPPA，NPPB和SBK2），提示识别这几个基因编码的蛋白的自身反应性T细胞可能逃脱了胸腺的阴性选择。
RNA测序数据提示，MYH6，NPPA，NPPB和SBK2在心脏中高表达，但在胸腺中不表达。
依据这四个基因编码的蛋白，研究人员设计了一个含有172个重叠肽的库，来测试它们与前面发现的7个TCRs的结合情况。结果发现，有三个TCRs可以被Myh6基因编码的α-肌球蛋白肽段激活。其中TCR-A和TCR-B都对α-肌球蛋白肽MYH6181-200有反应，而TCR-C对α-肌球蛋白肽MYH6406-425有反应。
研究人员又进一步在这两个含有20个氨基酸多肽中寻找具有免疫原性的抗原表位。最终确认TCR-A和TCR-B识别MYH6191-198 (VIQYFASI)，而TCR-C识别MYH6418-425 (VQQVYYSI)，且这两种抗原肽可以与小鼠的MHC Ⅰ类分子H2-Kb结合。此外，对9只Pdcd1–/–Ctla4+/–心肌炎小鼠进行分析发现，6-30%的心脏浸润CD8+T细胞对两种α-肌球蛋白肽中的一种具有特异性。
将表达不同TCR的Jurkat细胞系与抗原呈递细胞BMDCs共培养，加入预测的蛋白肽后可以激活NFAT-GFP信号，结果提示TCR-A和TCR-B识别MYH6191-198 (VIQYFASI)，而TCR-C识别MYH6418-425 (VQQVYYSI)。
经过这样一系列的探索，终于在小鼠模型中找到了真凶，那么在患者身上是否也是类似的情况呢？
研究人员对三名患者的活检或尸检样本进行分析发现，他们的心脏中都存在识别α-肌球蛋白的T细胞。这提示在患者身上也可能存在着类似的机制。
总的来说，这项工作揭示了引起ICI-MC的关键抗原，这对于理解这一严重不良反应的机制有着重要意义。此外，这一发现也将有助于开发生物标志物，来预测哪些患者患心肌炎的风险更高；也将有助于开发诱导免疫耐受的方法，来治疗或预防这一不良反应。
参考文献
1.Moslehi JJ, Salem JE, Sosman JA et al. Increased reporting of fatal immune checkpoint inhibitor-associated myocarditis. Lancet 2018; 391: 933.
2.Wang DY, Salem JE, Cohen JV et al. Fatal Toxic Effects Associated With Immune Checkpoint Inhibitors: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol 2018; 4: 1721-1728.
3.Salem JE, Manouchehri A, Moey M et al. Cardiovascular toxicities associated with immune checkpoint inhibitors: an observational, retrospective, pharmacovigilance study. Lancet Oncol 2018; 19: 1579-1589.
4.Axelrod ML, Meijers WC, Screever EM et al. T cells specific for alpha-myosin drive immunotherapy-related myocarditis. Nature 2022; 611: 818-826.
5.Wei SC, Meijers WC, Axelrod ML et al. A Genetic Mouse Model Recapitulates Immune Checkpoint Inhibitor-Associated Myocarditis and Supports a Mechanism-Based Therapeutic Intervention. Cancer Discov 2021; 11: 614-625.
6.Johnson DB, Balko JM, Compton ML et al. Fulminant Myocarditis with Combination Immune Checkpoint Blockade. N Engl J Med 2016; 375: 1749-1755.
7.Jutz S, Leitner J, Schmetterer K et al. Assessment of costimulation and coinhibition in a triple parameter T cell reporter line: Simultaneous measurement of NF-kappaB, NFAT and AP-1. J Immunol Methods 2016; 430: 10-20.
8.Gabrielsen ISM, Helgeland H, Akselsen H et al. Transcriptomes of antigen presenting cells in human thymus. PLoS One 2019; 14: e0218858.
责任编辑丨应雨妍