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用 BEAM 技术可以在一星期的时间内找出针对十几个抗原的几百个单克隆抗体。
BEAM 是 10X Genomics 公司最新上市的一项快速得到单细胞 BCR、TCR 序列以及相应抗原信息的技术。而获得单细胞 BCR 序列的技术也就是获得单克隆抗体基因编码序列的技术。
BEAM 的工作原理是将受过特定抗原感染的人的外周血白细胞与用 DNA 标签链做了标记的抗原结合，再用单细胞测序的方法测出单细胞的 BCR或 TCR 序列与特定抗原的识别关系。
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用BEAM技术可以在一星期的时间内找出针对十几个抗原的几百个单克隆抗体。
大家好，欢迎来到【陈巍学基因】，今天我要给大家讲《用 BEAM 技术找单克隆抗体》
BEAM 是 10X Genomics 公司最新上市的一项快速得到 BCR、TCR 序列以及相应抗原信息的技术。
BEAM 是 Barcode Enabled Antigen Mapping 的首字母缩写，翻译成中文是“条形码赋能的抗原映射”的意思。
获得 BCR 序列的技术也就是获得单克隆抗体基因编码序列的技术。
我们的讲解将分三部分内容：
1、BEAM 实验方法
2、抗原特异性评分和软件展示
3、相比于传统找单克隆抗体方法的优点
我们先说“BEAM 的实验方法”
这是 BEAM 方法找 BCR 和 TCR 的工作流程图，接下来我们将会分步讲解这个工作流程。
找 BCR 的工作流程，和找 TCR 的工作流程，这两者之间会略有差别。
我们先说找 BCR 的工作流程。
首先，制备好纯化好的抗原，并把抗原标上生物素。
同时制备 BEAM conjugate，BEAM conjugate 翻译成中文意思是“BEAM 偶联试剂”。
它包含了三个组成部分：
一是链霉亲合素，链霉亲合素的作用是会和生物素牢固结合；
二是一个 PE 荧光基团，荧光基团的作用是可以在流式细胞仪上对与之亲合吸附的细胞进行筛选；
三是连着一段 DNA 标签序列，这个 DNA 标签序列的作用是可以在后面通过测序，来确认连的是哪一个抗原；
10X 公司在 BEAM 实验设计中，一次可以用最多 16 种 DNA 标签序列标记，最多 15 个抗原，再外加一个阴性对照
然后，连着生物素的抗原，和这个 BEAM 偶联试剂混合。生物素与链霉亲合素相结合，抗原就和荧光基团、DNA 标签链连在了一起，形成一个 BEAM 抗原偶联复物。
接下来，是把已被感染的人的外周血白细胞样本，和 BEAM 抗原偶联复合物，和针对 B 细胞的荧光抗体，以及可选的抗细胞表面蛋白的抗体，合并在一起孵育。
这样孵育的结果，是 B 细胞上的 BCR 会结合到它所识别的抗原上；针对 B 细胞的荧光抗体也会结合到 B 细胞上；抗细胞表面蛋白的抗体，也会结合到特定的细胞表面蛋白上。
接下来，是用流式细胞仪对细胞进行筛选。
其中有针对 B 细胞荧光抗体标记的，并且有 PE 荧光标记的细胞，会被筛选出来。
接下来，是用 10X Genomics 公司的微流控系统，把这些带了抗原、DNA 标签链、荧光抗体的 B 细胞，分散进油包水的乳浊液小液滴中。并且小液滴中还包含进了带 DNA 标签链的 10X 凝胶微珠。
然后，这些微滴中的各种核酸链，在酶和微珠上的 DNA 标签链的共同作用下，合成出各种研究人员想要的核酸链。
新合成出的带标签的核酸链包括：
1、第一种是从 mRNA 合成出的全长的 cDNA 链，这一方面可以接下来构建 5’ 端 cDNA 链文库，提供了全面的 mRNA 表达信息；另一方面，还可以从中进一步构建 VDJ 文库，我们在后面会具体说到；
2、第二种是 BEAM 特征的 Barcode 链，后面可以从这些 BEAM 特征的 barcode 信息中，还原出这个 B 细胞结合的是哪一种抗原，这样就可以把这个细胞的抗体和目标抗原信息对应起来；
3、第三种是针对细胞表面蛋白抗体所连的特征 barcode 链，这可把细胞表面蛋白的信息，和这个特定的细胞联系起来。
这是从 5’端 cDNA 来构建 VDJ 文库的过程，先通过 P5 的引物，和针对抗体下游的 PCR 引物，把编码抗体的序列扩增出来。
然后，通过酶切的方法，把扩增出来的编码抗体的序列切成长长短短的片段。
接着，对片段进行加“A”，连上接头，通过 PCR 扩增，变成测序文库。
因为这个文库中，下游端的序列是长长短短的，后面就可以通过拼接，把属于同一个细胞的长长短短的抗体编码序列，给拼接成一个完整的抗体（基因）序列。
最后，可以构建出 4 种文库，分别是：
1、单细胞的 5’端的基因表达文库；
2、BEAM 文库，也就是标示了各个单细胞对应的抗原标签信息的文库；
3、BCR 或抗体序列文库；
4、细胞表面蛋白的文库。
有了上述的 4 种文库之后，就可以通过深度测序，和生物信息学分析，得到所需要的 BCR 信息、抗体基因信息、相应的抗原信息，还有基因表达信息、以及细胞表面蛋白的信息。
说完了找 BCR 的流程，接下来说找 TCR 序列的工作流程。
因为 T 细胞被免疫激活的过程中，需要 MHC 复合物（Major histocompatibility complex，主要组织相容性复合物）呈递肽段，所以，找 TCR 的实验方法略微不同于找 BCR 的方法。
一、选用的抗原是小的肽段，而不是完整的蛋白，选用的肽段的长度为 9 到 12 个氨基酸；
二、挑选好 MHC 的单体，并在 MHC 单体上连上生物素；
三、偶联的过程，把肽段、生物素标记的MHC单体、带了 PE 荧光基团和 BEAM 标签序列的链霉亲合素。
将这三者偶联到一起，形成 BEMA-T 组装复合物。
然后，把 BEAM-T 组装复合物，和被感染的人的外周血的白细胞，以及带荧光的识记 T 细胞的抗体，还有可选的带标签链的识别细胞表面蛋白的抗体，混合在一起进行孵育。让 T 细胞，和带相应抗原的 BEAM-T 组装复合物相互识别、结合。
再接下来，用流式细胞仪对细胞进行筛选，找出带荧光标记的 T 细胞识别的复合物。接下来，用 10X 微流控系统把细胞分散成油包水的乳浊液小液滴，并在小液滴中包含进了带 DNA 标签链的 10X 凝胶微珠。
然后，这些微滴中的各种核酸链，在酶和微珠上的 DNA 标签链的共同作用下，合成出各种研究人员想要的核酸链。合成核酸链和建库的过程和 BCR 类似，这里不做赘述。
再接下来，深度测序、生物信息学分析，得到研究者想要的信息。
第二部分，我们来说抗原特异性评分和软件展示。
抗原特异性评分，Antigen Specificity Score，是 10X 公司定义的一个评分。它显示一个细胞 barcode 和一个目标抗原的关联关系，相比于阴性对照有多强。
分值从 0 到 100；
分值越高，对抗原的特异性越高；
Cell Ranger 软件会在细胞 barcode 的水平上计算出这个分值。
这是一个“抗原特异性评分”表格的实例。
我们可以看到，这一列，就是“抗原特异性评分”。这在一列中，有几个格子的数值特别高，我们看框出来的这个小格子，分值高达 98 分。它对应到 101 个抗原 UMI，而且这些抗原 UMI 关联到 BEAM13 这个抗原。
这样，就把一个细胞中产生的抗体，和这个抗体对应到哪个抗原，还有抗体对抗原结合的特异性，这三方面的信息结合到一起了。
10X 公司专门开发了展示 VDJ 信息的软件 Loupe V(D)J Browser。
图中是这个软件的界面。图中的每一个点，代表了一个表达 BCR 或者 TCR 的细胞，聚在一起一团点，是属于同一个克隆类型的细胞。不同的克隆类型的细胞组成不同的细胞团，细胞团之间由空白空间区隔开。
这两张图，分别展示了针对抗原 1 和抗原 2 的不同的 TCR 的 T 细胞的分组情况。
第3部分，BEAM 方法相对于传统找单克隆抗体方法的优点。
传统的用杂交瘤技术获得单克隆抗体的方法有以下的缺点：
一、它基于微孔板，低通量；
二、失败率高，原因是低的融合效率&细胞培养中的污染风险；
三、是不能对多重抗原进行筛选；
四、是命中克隆的多样性低；
五、是杂交瘤不稳定，（生产出的单克隆抗体）有批间差异。
用传统的噬菌体展示的方法获得单克隆抗体的缺点：
一、缺失了 BCR （或抗体）的重链与轻链的配对信息；
二、在大肠杆菌中表达的蛋白，与人体细胞表达的蛋白有折叠偏差和修饰的不同。
BEAM 方法的优点如下：
一、一次可以针对多达15个抗原同时进行筛选；
二、一次实验可以找到几百个命中抗原的抗体；
三、完全配对的重链和轻链信息；
四、速度更快，只需要一周时间。这相对于传统方法要花约3个月的时间；
五、还可以获得细胞状态的信息，包括 RNA 表达和细胞表面蛋白信息；
六、能够找到稀有的 B 细胞株。