大家好，我是否认冶游史。今天给大家分享一篇发表在Nature上的非肿瘤文章，题目为：“Single-nucleus profiling of human dilated and hypertrophic cardiomyopathy” --人类扩张型和肥厚型心肌病的单细胞核转录图谱。
单细胞测序大家并不陌生，而单细胞核测序又有什么特点呢？我们一起来学习一下吧！
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研究背景
单细胞测序（scRNA-seq）&单细胞核测序（snRNA-seq）
两种测序方式各有其优劣，单细胞测序的局限：1.仅适用于新鲜样本：单细胞悬液质量要求很高（细胞数量、活性、浓度等），很多超低温保存的样本无法进行scRNA-seq。2.解离过程细胞的丢失：某些类型的细胞难以解离，而某些敏感类型因解离过度而破碎。3.不适用于含大细胞的样本：某些较大细胞上机前被过滤掉。4.制备过程中，外界刺激导致细胞转录状态的改变，引起偏差。
单细胞核测序避免了上述这些局限性，但依旧存在劣势：1.检测到的基因较少，缺失了细胞质中的mRNA。2.获得免疫细胞较少。
DCM&HCM
扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy, DCM）和肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy, HCM）都是心衰的病因，二者至终末期均可发展为心衰，带来严重的公共健康负担。本研究通过单细胞核测序数据，探索DCM和HCM的转录组多样性，发现其潜在的治疗靶点。
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研究内容
1. Expression profiles ofcardiomyopathies
2. Changes in cell subpopulations
3. Activated fibroblasts in DCM and HCM
4. Validation of activated fibroblasts
5. Cardiac fibrosis assay
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研究结果
1. Expression profiles of cardiomyopathies
1.作者共对11个DCM&15个HCM(均为晚期)，16个NF（non-failure）样本的592689个细胞核进行了测序。
2.将测得的转录组数据进行聚类，得到21个cluster（下图a）
3. NF/DCM/HCM的细胞类型比例有所不同：与NF相比，DCM和HCM的心肌细胞含量较低，而血管平滑肌细胞和活化的成纤维细胞含量较高（下图b,c）
作者将每个样本的单细胞核测序数据合并，构成pseudo-bulk sequencing数据（伪bulk数据）
对pseudo-bulk数据进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）：PC1(28.5%)可将NF与心肌病组（DCM和HCM）区分开；PC2(17.1%)可区分不同性别患者（下图d）
通过鉴定每种细胞的差异基因 (DCMvsNF, HCMvsNF, DCMvsHCM)发现：①DCM或HCMvsNF差异基因很多，而DCMvsHCM差异基因很少(FDR<0.01)；②差异基因主要集中在成纤维细胞（灰）（下图a）
由此可以得知：当DCM和HCM发展到晚期时（样本均为晚期），二者转录谱相似
对不同细胞类型的差异基因进行富集分析，仅展示FDR<0.05的通路（下图d）
•方块大小代表P值
•颜色代表NES(Normalized enrichment score)的正负
•横坐标：D代表DCMvsNF组；H代表HCMvsNF组
2. Changes in cell subpopulations
对于一个给定的细胞类型，如成纤维细胞，NF/DCM/HCM的细胞亚群是否有区别？
作者对含量最多的几种细胞类型进行再聚类：（下图a-f，左）
•三者在多种细胞亚群上存在差异（下图a-f，中），例如在Fibroblast的亚群中，Act.FB（活化的成纤维细胞）在DCM/HCM中的含量较高，而在正常（NF）中含量较少。
作者展示了不同细胞亚群与Marker基因的关系（下图a-f，右）
•气泡大小代表该基因在该亚群的表达比例
•气泡颜色深浅代表平均表达量的高低
作者也对特定亚群的Marker基因的生物学意义作了阐述
其中，巨噬细胞鉴定出4个亚群，其中增殖型巨噬细胞(Prolif Mφ)尤为特殊（下图a），特点如下：
•很高的细胞周期分数（细胞周期预测）（下图b,c）
•很多上调的细胞周期相关基因（下图d）
•在DCM/HCM中的含量较NF低（随后有免疫荧光验证）
•各亚群在DCM/HCM/NF中的丰度比较
•免疫荧光同时染色巨噬细胞Marker(CD163)和细胞周期Marker(MK167)，验证Prolif Mφ在不同组织中的含量，红绿均有即为Prolif Mφ。可以发现，Prolif Mφ在正常样本中含量较高，而在DCM/HCM样本中含量较少。
•与CCR2+和CCR2-巨噬细胞的Marker比较，发现Prolif Mφ与CCR2-巨噬细胞非常相似（下图h,i）。
3. Activated fibroblasts in DCM and HCM
作者将活化的成纤维细胞单独讨论：
活化的成纤维细胞在DCM/HCM中含量较高，而在NF中很罕见，下图a展示了不同样本中的活化的成纤维细胞的含量
已知的活化成纤维细胞Marker基因均有上调(POSTN, NOX4, FAP, COL1A1 and COL1A2 )，且发现了两种新Marker基因(FAM155A, TSHZ2)（下图b）
用高度特异的活化成纤维细胞Marker基因—COL22A1和普通成纤维细胞Marker基因—DCN，对DCM/HCM/NF样本进行RNA原位杂交，结果显示仅DCM和HCM组有活化的成纤维细胞，验证了上述结论。
为进一步探究静息成纤维细胞→活化成纤维细胞的表达梯度，对活化的成纤维细胞含量最高的两个样本(P1304,P1425)做拟时序分析（下图c-e）：
•部分基因全程高表达，部分基因全程低表达（下图f）
•部分基因在不同阶段选择性表达（下图f）
•是否存在中间态？有待探索
4. Validation of activated fibroblasts
结合既往研究的数据库，对上述结论进行验证（活化的成纤维细胞仅在疾病组存在）：
•MAGNet研究(bulk数据)与此研究有34个共同样本，用反卷积方法计算bulk数据的成纤维细胞比例
•反卷积MAGNet所有样本的bulk数据，计算各样本成纤维细胞比例
•利用GSE116250和GSE130036数据集，同样进行反卷积，均成功验证上述结论
5. Cardiac fibrosis assay
作者基于上述发现设计了一种心脏纤维化的评估试验。
背景知识：心肌成纤维细胞在TGFβ1的作用下→肌成纤维细胞→心脏纤维化 (此过程中SMA↑)
因此可用SMA（平滑肌肌动蛋白）的含量来间接衡量心肌成纤维向肌成纤维的转化情况
利用CRISPR-Cas9技术，分别对活化成纤维细胞轨迹中的27种基因进行敲除
阴性筛选组：12种非靶向sgRNA(non-targeting control single-guide RNA)和靶向心肌细胞5个特异基因的10种sgRNA
阳性筛选组：敲除参与TGFβ信号通路的基因，如ACTA2, TGFBR1, TGFBR2, SMAD2 and SMAD3
敲除27个基因和TGFβ相关基因导致心肌成纤维→肌成纤维受阻，使肌成纤维含量下降，SMA↓
部分sgRNA多次重复筛选均有显著且稳定的敲除效果，如PRELP, JAZF1, COL22A1 and AEBP1（下图已标出）
因此，针对活化心肌成纤维细胞基因的CRISPR-Cas9技术或许可作为心肌纤维化的有效干预措施
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总结
1.本研究全面描绘了人类DCM和HCM的单细胞核转录图谱
2.确定了晚期心肌病患者的某些共同通路
3.发现了晚期心肌病患者巨噬细胞含量减少而活化的心肌成纤维细胞含量较高并验证
4.鉴定出某些基因对心肌成纤维细胞活化的作用
5.扩大了目前对于心脏中这些细胞的认识，提供了新的心肌病干预思路
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