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《细胞研究》:重大进展!施一公团队首次确定APOE4特异性受体,为阿尔茨海默病的治疗打开新局面

*仅供医学专业人士阅读参考
载脂蛋白E(APOE)是由肝细胞和脑组织等合成的一种分泌蛋白,可与不同细胞表面的多种受体结合,在脂质代谢、免疫调节和神经学等方面发挥关键作用[1]。
APOE有3种常见亚型,APOE2、APOE3、APOE4,它们仅在第112、158位两个氨基酸位置上存在不同,却表现出众多生理和病理功能上的显著亚型差异[2]。
有研究表明,与最常见的APOE3亚型相比,APOE4大幅增加早发阿尔茨海默症(AD)风险,而APOE2则降低AD风险[2]。
不知道大家有没有想过:区区两个氨基酸的不同,为何带来这么大的差异呢?
近日,由西湖大学施一公和周家耀领衔的研究团队,在著名期刊《细胞研究》发表一项重要研究成果[3],回答了上述问题。
他们首次发现,小胶质细胞表面的免疫检查点受体蛋白LilrB3是APOE4的特异性受体,几乎不与APOE2结合。他们还在人类小胶质细胞上发现,APOE4与LilrB3特异性结合后,可激活小胶质细胞,使其转为促炎状态。
据了解,这也是科学家首次在免疫细胞表面发现能特异性结合APOE4,而几乎不与APOE2结合的受体蛋白。西湖大学生命科学学院博士后周家耀、清华大学生命科学学院博士生王雨蒙为本文的共同第一作者。
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论文首页截图
AD最显著的临床表现是记忆衰退,而记忆的形成与神经突触的连接有很大的关系。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞,其异常激活引起对神经突触的修剪(即吞噬),是导致AD患者“失忆”的重要原因[4]。
小胶质细胞表达丰富的白细胞免疫球蛋白样受体B(LilrB)膜蛋白受体,LilrB同PD-1一样也是重要的免疫检查点蛋白,控制着小胶质细胞的活化[5]。早在2008年,科学家就发现,LilrB受体家族的小鼠同源蛋白PirB在神经突触的修剪中扮演重要角色[6],而LilrB受体家族的配体一直没被找到
施一公团队综合大量的研究成果以及实验探索,逐渐形成了关于AD发病机制的大胆猜想:APOE4而非APOE2与LilrB/PirB受体家族结合,从而激活小胶质细胞,引起突触修剪和记忆丧失,导致AD。
接下来让我们看看施一公团队是如何逐步验证这项假设的。
首先,研究团队交叉检测了6种LilrB/PirB家族蛋白的胞外段(ECD)与3种APOE亚型的相互作用。研究结果表明,仅APOE4与LilrB3-ECD之间存在明显的蛋白结合,且呈剂量依赖性,APOE3与LilrB3-ECD也有较弱的结合,而APOE2则不与任何LilrB/PirB-ECD结合。
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体外检测发现,APOE4仅与LilrB3-ECD特异性结合
相应地,借助不同的荧光蛋白标记,把表达LilrB/PirB完整蛋白的HEK293F工具细胞与APOE4共孵育,再次证实APOE4仅与LilrB3存在相互结合。
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APOE4可被细胞表面的LilrB3特异性识别
接下来,研究团队探究了APOE4与LilrB3结合的具体部位。
已知APOE的N-端结构域(NTD,第1-167位氨基酸残基)含有可能的受体结合区域,C-端结构域(CTD,第207-299位氨基酸残基)含有脂质结合区域。然而,实验数据表明3种APOE的NTD与LilrB3-ECD具有相似的亲和力,这与前面测得的3种完整的APOE与LilrB-ECD具有不同的亲和力形成鲜明对比。
由此可以推测,APOE的CTD可能是APOE识别结合LilrB3的负调因素,抑制NTD与LilrB3的结合。各APOE亚型的CTD序列相同,对NTD的抑制程度却不同,那么显然,位于NTD内的第112、158位差异氨基酸是CTD抑制NTD的关键。
为了定位APOE4-NTD被LilrB3-ECD结合的氨基酸残基,研究团队构建了52种APOE4-NTD的突变体,每种突变体改变NTD的一个表面氨基酸残基。有14种突变体与LilrB3的结合能力显著下降,结合力不足野生型APOE4的30%,这14个突变体中的12个都定位到NTD的1号和4号螺旋,且主要是碱性氨基酸残基(带正电荷)。由此推测,APOE4-NTD的这些氨基酸残基组成了一个带正电荷的表面斑块,是与LilrB3结合的关键。
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LilrB3识别APOE-NTD的一个带正电荷表面斑块
同时,研究团队通过结构分析和突变体测试,最终确定了APOE-CTD中与NTD第112、158位氨基酸相互作用的区域,这一CTD区域与NTD构成分子内相互作用,阻碍了NTD与LilrB3的结合
由于仅LilrB3与APOE4特异性结合,而LilrB3和LilrB2的ECD都由4个免疫球蛋白样结构域(D1-D4)串联组成,序列同源度较高,因此,通过相互替换LilrB3与LilrB2的ECD内结构域,研究团队发现LilrB3-ECD的D2和D4是识别APOE4的关键。
类似地,通过相互替换LilrB3与LilrB2的D2和D4内的部分片段,研究团队确认了D2内的3个和D4内的5个片段至关重要。并且,人工智能蛋白结构预测软件AlphaFold显示,这8个片段都位于LilrB3-ECD表面的同一侧。
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LilrB3-ECD的D2和D4结构域所含片段构成了识别结合APOE4的表面斑块
最后,研究团队应用冷冻电镜(cryo-EM)分析技术,揭示了APOE4与LilrB3复合体的超高分辨率(3.0Å)空间结构。
APOE4与LilrB3形成2:2的四聚体复合物,两个LilrB3反向排列,两个APOE4位于两个LilrB3之间,每个APOE4-NTD与一个LilrB3的D2和另一个LilrB3的D4接触,形成氢键和范德瓦尔斯力,从而拉近了两个LilrB3的胞内信号转导区域。这种复杂而巧妙的空间结构,与前面的识别区域的研究结果相互吻合。
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APOE4与LilrB3相互识别结合的结构基础
研究团队还以人类小胶质细胞(HMC3)为代表,验证了APOE4与LilrB3特异性结合,并进行了RNA测序和差异表达基因分析。结果发现,APOE4与LilrB3的结合可上调干扰素、细胞因子、抗病毒等信号通路,激活小胶质细胞转为促炎状态
总的来说,施一公和周家耀团队的这项重磅研究,首次解析了APOE与受体结合形成的复合体的空间结构,为研究APOE亚型依赖的功能差异和致病机制提供了重要的结构基础。
研究发现的APOE4与LilrB3的特异性结合激活小胶质细胞转为促炎状态这一现象,进一步揭示了APOE4促进AD发生的分子机制。
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参考文献
[1]. Holtzman DM, Herz J, Bu G. Apolipoprotein E and apolipoprotein E receptors: normal biology and roles in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012;2(3):a006312. doi:10.1101/cshperspect.a006312
[4]. Wang C, Yue H, Hu Z, et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 2020;367(6478):688-694. doi:10.1126/science.aaz2288
[5]. Gosselin D, Skola D, Coufal NG, et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 2017;356(6344):eaal3222. doi:10.1126/science.aal3222
[6]. Atwal JK, Pinkston-Gosse J, Syken J, et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 2008;322(5903):967-970. doi:10.1126/science.1161151
责任编辑丨BioTalker
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