氟伏沙明激活Sigma-1受体减轻肺动脉高压继发右心室功能不全

肺动脉高压（PAH）是一种以肺小动脉进行性重构、管腔狭窄和内皮功能障碍为特征的综合征，可诱发右室重构和心力衰竭。因此有必要减少右室功能障碍，以避免严重的心脏后果。

Sigma-1受体（S1R）是一种配体门控分子伴侣蛋白，存在于内质网和质膜中，并通过调节钙稳态和未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）发挥重要生理功能，广泛运用于抑郁症等精神疾病的治疗中。近年来研究发现S1R在左心室中的重要作用：动物实验显示，敲除S1R的小鼠表现出线粒体功能障碍和心脏重构异常，最终出现收缩功能障碍；进一步使用SIR激动剂氟伏沙明显著缓解了主动脉缩窄动物的心力衰竭和心脏功能障碍。尽管S1R在右心室也有高表达，但对于其功能和在右室功能不全中的作用知之甚少。

本文Chronic Sigma 1 receptor activation alleviates right ventricular dysfunction secondary to pulmonary arterial hypertension阐明了Sigma-1受体在肺动脉高压继发右室功能障碍中的作用机制，进而发现氟伏沙明激活Sigma-1受体减轻肺动脉高压继发右心室功能不全。

肺动脉高压（PAH）是一种以平均肺动脉压进行性升高为特征的慢性疾病，伴随着肺动脉充血、重塑异常和右室后负荷增加，最终导致右心衰竭和死亡。尽管近年来在药物策略（如，钙通道拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶5型抑制剂、前列环素类似物等）方面取得了重大进展，但PAH的发病率和死亡率仍然很高，5年生存率仅为50%。因此，新的治疗策略对于改善PAH患者的预后是必要的。

在PAH动物模型中，氧化应激增加，并促进PAH的发展。氧化应激在肺血管重塑中起着关键作用，进而增加右心室后负荷，导致右心室肥厚，并最终导致右心室衰竭。然而，右心室损伤和重塑的确切致病机制尚不清楚。大量研究表明，应激反应转录因子Factor-Erythroid 2 P45-Related Factor2（NRF 2）在生理条件下可诱导细胞多种保护酶从而维持活性氧（ROS）的稳定状态。在氧化应激反应中，NRF 2活性增加以减轻过量ROS的损伤。此外，已有研究证明，在PAH动物模型中，NRF 2的药理活性可减轻右室的纤维化和炎症。

近年来，新的证据表明脑S1R有助于减轻心脏肥厚、缺血-灌注损伤、心房颤动以及心力衰竭。此外，早前已有研究揭示S1R在减少氧化应激中发挥重要作用，包括在神经、视网膜Müller胶质细胞以及肝和肺等组织的作用。值得一提的是，NRF 2活性降低也是由S1R调节异常引起的氧化应激损伤的一个重要条件；此外，NRF 2活性的调节对视网膜视锥感光细胞中S1R激活介导的氧化应激保护至关重要。S1R在右室中的直接作用，尤其是在右心室衰竭中的作用，很少被关注。因此，本研究推测激活S1R可能通过降低氧化应激与调节NRF 2的活性来减轻大鼠PAH模型的右室重构和减轻右室功能障碍。

60只雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200～220g，随机分为对照组（CTL）、氟伏沙明组（FLU）、肺动脉高压组（PAH）和肺动脉高压+氟伏沙明组（P+F），每组15只。饲养适应1周后，于CTL组和FLU组大鼠腹腔注射0.9%无菌生理盐水（NS），PAH组和P+F组大鼠腹腔注射野百合碱（MCT，60mg/kg）诱导PAH。在注射MCT造模后第2周进行药物干预。CTL组和PAH组的动物在21天内每天腹腔注射NS；FLU组和P+F组大鼠则在第2周至最后一周给予S1R激动剂氟伏沙明（12 mg/kg），共21天。在注射MCT后第4周对动物实施安乐死以作进一步研究。

注射MCT后第4周进行经胸超声心动图检查：异氟醚（2%）麻醉大鼠，超声心动图使用高分辨率在体成像系统，所得二维图像稳定后进行超声检查。左心室射血分数（LVEF）=LV EDV-LV ESV）/LV EDV×100%）表示左室收缩功能，LV EDV和LV ESV分别代表左室舒张末期容积和收缩末期容积。在胸骨旁主动脉瓣水平记录肺流出血流多普勒脉搏波。在四腔心切面上，测量三尖瓣环平面收缩偏移（TAPSE）、右室收缩末期面积（RVSA）和右室舒张末期面积（RVDA）。右室收缩功能以面积变化分数（FAC）=（RVDA-RVSA）/RVDA×100%表示。

大鼠麻醉后放置于电热毯上，分离右颈动脉和静脉，将一个连接到多通道生理监测系统（BioPAC MP150）的PU管小心地送入房室和肺动脉。用LabChart 8软件测定平均肺动脉压(mPAP)、右室收缩末压（RV ESP）和右室舒张末压（RV EDP）。采用大鼠N端B型利钠肽原（NT-Pro BNP）ELISA试剂盒检测血浆NT-Pro BNP水平。生化检测血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)的变化，提示氧化防御作用。

在经胸超声心动图检查后大鼠被安乐死，迅速摘除心脏和肺进行进一步分析。通过计算右心室（RV）与左心室（LV）和室间隔（S）的比值（RV/LV+S）来测量右室肥厚水平。取右室组织和肺组织，用10%福尔马林溶液固定。切片后按标准组织学方法染色，包括Masson三色染色、麦胚凝集素（WGA）染色和苏木精伊红（HE）染色。右室组织采用Masson三色染色和WGA染色，肺组织采用HE染色。用ImageJ软件对纤维化程度（蓝绿色纤维化）和心肌细胞横截面进行量化。通过测定每只大鼠10个小动脉的壁厚百分比(WT%)=[（外径-内径）/外径×100和壁面积百分比（WA%）=[（总面积-腔面积）/总面积]×100来评价肺血管重构。采用二氢乙锭（DHE）荧光染色法测定右室组织中ROS的生成，用ImageJ软件测量荧光强度。

为确定S1R在肺小动脉中的表达，用0.01%Triton X-100对肺组织切片进行稳定，并用5%正常胎牛血清在室温下阻断1h。然后用S1R和α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）抗体在4℃下固定染色过夜，然后用四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）与山羊抗兔抗体（1:100）偶联，室温黑暗染色1h。DAPI染色8min。图像通过显微镜获得。

大鼠在深麻醉状态后取出右室，在液氮中快速冷冻。蛋白质提取和蛋白印迹用标准技术进行。用抗S1R(1:1000)、NRF2(1:1000)、NADPH氧化酶2(NOX2,1:1000）、NADPH氧化酶4(NOX4,1:1000)、血红素氧化酶-1(HO-1,1:3000）和胶原I(1:500）的抗体检测膜。将不同蛋白的水平归一化到3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，1:10,000）水平，以便进一步分析。WB印迹的图像用ImageJ软件进行扫描和分析。qRT-PCR分析NRF 2和HO-1的相关表达。引物由引物Express软件包设计,将不同RNA水平归一化为GAPDH。采用ABI PRISM 7900序列检测系统软件进行数据分析。

采用IBM SPSS23或GraphPad PRISM8进行统计分析。连续变化以均值±标准差表示，比例以百分率报告。组间比较采用方差分析(ANOVA）。统计学意义为P≤0.05。

注射MCT后第4周行经胸超声心动图和血流动力学检查，检测大鼠心功能变化。与CTL组相比，PAH组明显存在右室功能障碍，表现为TAPSE缩短（图1b，1e)，RV ESP升高（图1a，1d）和RV EDP升高（图1a，1c）。更直接地说，与CTL组相比，PAH组FAC减少（图1f）提示右室功能受损。正如所预期的，单独给予氟伏沙明并没有改变右室功能，在FLU组和CTL组动物中没有显示出差异（图1a-1f）。与PAH组相比，P+F组右室功能明显改善，表现为TAPSE增加（图1b、1e）和RV EDP减少（图1a、1c）。同样，P+F组RV FAC部分恢复（图1f)，而P+F组RV ESP与PAH组一致（图1a、1d）。

PAH大鼠房室壁胶原沉积明显增加，血管周围（图3a，3b）和间质间隙（图3a，3c）的Masson三色染色显示纤维化明显扩大。在实验中，氟伏沙明没有改变正常动物血管周围RV的纤维化（图3a、3b、3c）。值得注意的是，氟伏沙明激活S1R可显著减轻PAH大鼠房室壁纤维化（图3a、3b、3c）。MCT造模显著增加了绝对RV/(LV+S)（图3f），验证了PAH严重的右室肥大。相比较而言，在微观水平上观察到相同的结果，如WGA染色试验所示（图3d,3e）。P+F组大鼠RV/(LV+S)显著减少（图3f），心肌细胞WGA染色平均横截面积显著减少（图3d，3e）。PAH组mPAP显著升高（图2a、2b）。慢性激活S1R不影响正常大鼠的肺动脉压（图2a，2b)，也不降低PAH大鼠的肺动脉压（图2a，2b）。肺动脉重构是MCT诱发PAH最显著的特征。PAH组肺动脉壁增厚，与CTL组相比，WA%增加（图2c，2d）和WT%增加（图2c，2e）。S1R的激活不影响肺微血管的重构，肺动脉的改变与肺小动脉中S1R表达的缺失有关（图2f）。

DHE染色显示PAH组右室活性氧含量明显高于CTL组（图4a、4b）。此外，提示脂质过氧化的血浆MDA浓度也升高（图4C），血清中抗氧化酶SOD下调（图4d）。有趣的是，氟伏沙明给药缓解了这种飙升的氧化应激水平，如DHE（图4a、4b）和血清MDA浓度（图4c），抗氧化能力恢复（图4d），尽管它对正常大鼠没有影响。WB检测S1R的表达水平，以确定其主导作用。MCT显著降低右室中S1R的表达，与基线相比降低了约87.5%（图5a，5b），给予氟伏沙明后部分恢复（图5a，5b)。NADPH氧化酶（NOX）是心脏中最常见的活性氧来源之一。PAH显著提高了右室中NOx2和NOx4的表达（图5a、5c）和（图5a、5d）。与上述结果不同的是，氟伏沙明不影响PAH大鼠NOx2（图5a、5c）和NOx4（图5a、5d）的表达。以上结果表明NOx表达不参与激活S1R减轻肺动脉高压氧化应激的过程。升高的ROS可影响NRF2的表达。正如预期的那样，PAH大鼠右室中NRF 2的表达下调，如PAH组与CTL组相比所示（图5a，5e）。此外，NRF 2的RNA水平在两组中显示相同的变化（图5h）。在P+F组中，氟伏沙明激活S1R使得NRF 2的蛋白和RNA水平被显著挽救（图5a，5e，5h）。类似地，PAH组中HO-1表达显著降低（图5a，5f，5i），但在P+F组中，氟伏沙明使得OH-1（图5a，5f，5i）部分恢复。与CTL组相比，PAH组右室中I型胶原水平的升高进一步证实了纤维化（图5a，5g）。与PAH组相比，氟伏沙明显著降低了I型胶原的表达（图5a，5g），使得纤维沉积的减少。

迄今为止，PAH的潜在机制尚未完全阐明。在PAH患者和PAH模型动物的肺部，氧化应激水平都有所增加，并促进PAH的发展；此外，研究也显示氧化应激也在肺血管重塑中起着重要作用。降低活性氧生成的药物可以改善PAH的结构重塑，阻止PAH的发生和发展。在氧化应激反应中，NRF 2活性增加，以减轻ROS过量堆积的损伤。S1R在肺和肝的生理状态以及在视网膜退行性疾病、脂多糖引起的星形胶质细胞损伤和肌萎缩性侧索硬化等病理条件下都能维持ROS的平衡。此外，在视网膜退行性疾病和星形胶质细胞损伤中，S1R的保护作用是通过恢复失调的NRF 2激活介导的。本次研究结果表明:（1）S1R在PAH大鼠右心室中表达且下调；（2）氟伏沙明激活S1R可减轻肺动脉高压所致的右心室功能紊乱和结构重构；（3）氟伏沙明激活S1R不减轻PAH大鼠肺动脉压力及肺血管重构；（4）S1R部分通过NRF2/HO1途径介导的氧化应激发挥保护作用。因此，本研究为临床治疗右心室功能不全提供了一个潜在的治疗靶点。

图1 PAH动物和氟伏沙明治疗大鼠右室功能的变化。(a)四组的RVP，(b)四组的TAPSE，(c)RV EDP的统计结果(n=5)，(d)RV ESP的统计结果(n=5)，(e)TAPSE的统计结果(n=6)，(f)RV FAC的统计结果(n=6)，(g)血浆NT pro-BNP浓度的定量(n=8)，(h)四组LVEF(n=6)，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001

 

图2 肺小动脉的结构重塑。(a)四组PAP，(b)mPAP统计结果(n=5)，(c)肺组织HE染色（原始放大倍数×400)，(d)四组WA%(n=3只大鼠30条肺小动脉）(E)WT%(n=3只大鼠30条肺小动脉），(f)S1R在肺小动脉的表达情况；S1R（红色）、α-SMA（绿色）、DAPI（蓝色），*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。

 

图3 右室的结构重塑。(a)右室中Masson染色的代表性图像（原始放大倍数×100和×400),(b)血管周围间隙纤维化的定量(n=3)，(c)间质间隙纤维化的定量(n=3)，(d)右室中麦胚凝集素(WGA)染色的代表性图像（原始放大倍数×400)(n=3)，(e)右室中心肌细胞平均横截面积的定量，(f)RV/(LV+S)的定量(n=6)，***P<0.001

图4  右室和血清中的氧化应激。(a)右室中代表性的二氢乙锭(DHE)荧光染色， (b)RV中活性氧的量化(n=3)，(c)血浆MDA浓度的定量(n=8)，(d)血浆SOD浓度(n=8)的定量，原始放大倍数×200，*P<0.05，***P<0.001

 

图5 右室组织Western blot和qRT-PCR检测。(a)S1R、NOx2、NOx4、NRF2、HO1和胶原I（b-g）的印迹图像。S1R、NOx2、NOx4、NRF2、HO1和I型胶原蛋白水平与GAPDH(n=3)，(h)NRF2的RNA水平与GAPDH(n=3)，（i）HO-1的RNA水平与GAPDH(n=3)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

华潞  主任

中国医学科学院阜外医院

中国医学科学院阜外医院呼吸和肺血管病中心副主任

学术任职：

中国医疗保健国际交流促进会心脏重症分会副主任委员

中国毒理学会临床毒理专业委员会副秘书长/常务委员

中国研究型医院学会血栓与止血专业委员会常务委员

中国女医师协会心血管专业委员会委员

北京药理学会临床药理专业委员会副主任委员

《血栓与止血杂志》常务编委、《中国新药杂志》编委、《中国循环杂志》、《药物不良反应》等杂志通讯编委

发表文章130余篇，代表性研究及文章在European Heart Journal、Thrombosis Research等期刊发表

文献索引：Sun Y, Wan W, Zhao X, Han X, Ye T, Chen X, Ran Q, Wang X, Liu X, Qu C, Shi S, Zhang C, Yang B. Chronic Sigma 1 receptor activation alleviates right ventricular dysfunction secondary to pulmonary arterial hypertension. Bioengineered. 2022 Apr;13(4):10843-10856. doi: 10.1080/21655979.2022.2065953. PMID: 35473584; PMCID: PMC9208487.