视频内容简介
本视频介绍了10X Genomics 公司新推出的 Xenium 组织原位分析技术。
Xenium 技术通过对切片的原位核酸探针杂交，加上依赖 mRNA 的 DNA 连接反应，把 DNA 探针吸附到切片上目标 mRNA 所在的位置。
通过对探针的滚环复制，增加可杂交的位点。
再通过多轮的多色荧光标记寡核苷酸对样本进行杂交，用显微荧光扫描仪记录下每一轮的空间荧光信号。通过多轮的空间荧光信号的颜色信息，检测出目标 mRNA 在空间上的分布。
目前，10X 公司已推出了两款基础 panel，客户可以在基础 panel 的基础上定制化地增加最多 100 个目标基因。
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大家好，欢迎来到【陈巍学基因】,今天要和大家分享的是“10X Genomics 公司新推出的 Xenium 组织原位分析技术”。
这是 Xenium 分析仪的外观。它配合上专门的试剂和探针 panel、以及配套的软件，形成一个分析系统。
它相比于之前的 Visium 空间转录组系统最大的优点，是极大地提高了在空间上的分辨率。Visium 的空间分辨率是 65～100 微米，一个细胞的直径是几个微米，所以 Visium 的一个 spot （芯片上的一个“点”）往往对应到好几个细胞。也就是 Visium 的空间分辨率无法精确到单个细胞。Xenium 的光学分辨率，是 0.2 个微米，所以，它的分辨率就精确到单个细胞了，甚至可以精确到亚细胞结构。
Xenium 的仪器一次可以分析 2 张芯片，做一次分析大约花 2 天左右的时间。
Xenium 既可以检测冷冻切片，也可以检测 FFPE 切片。
这是 Xenium 用的芯片，大小接近于一张普通的载玻片。芯片中间检测样本切片的区域是“12 毫米 * 24 毫米”的大小。
Xenium 的探针的设计是很巧妙的。
通常我们会将许多种探针构成的一个实验中用的探针的组合称为一个“panel”，Xenium 的一个 panel 中一般会含有几百种到几千种探针。
我们先看对一个目标基因 mRNA 的一个特定位置设计的一个探针的情况。
这个探针的两端被设计成与（目标基因上目标位置的） mRNA 序列是互补的，并且在这个探针的两端都杂交到目标 mRNA 上之后，探针的两端正好是挨在一起的，将来可以被连接酶连接成环。
而且因为探针两端的这两个序列都要分别识别到目标 mRNA 上（也就是发生了 2 次杂交），所以可以提高这整个探针杂交的特异性。
同时探针上还有一段特别的标签序列被称为“gene-specific barcode”，这段特别的序列又分几截，每一截都是一段可以与后面要用到的某种荧光核酸链相互补的，可以通过杂交后发出的荧光信号对这一截序列加以识别。
用这个探针与组织切片进行杂交，探针就会杂交到目标基因 mRNA 所在的相应位置上。
接着，加入依赖 RNA 模板的 DNA 连接酶，在目标 mRNA 起到连接模板的作用下，连接酶把探针的两端连接起来。这样，探针 DNA 变成了一个环状的、单链的 DNA 链。
然后，加入 DNA 聚合酶和引物，引物吸附到环状的探针链上，聚合酶沿着环状的 DNA 探针进行滚环复制，复制出一条长链。这个长链可以包含多达几百个原始环状探针的拷贝，并且这条长链圈绕起来，形成一个毛线团一样的东西。
做这个滚环复制的目的是让探针序列扩增几百倍，以增强后面的荧光信号的强度。
然后，用分别带不同颜色的荧光基团的、有特定序列的寡核苷酸链对样本进行杂交。一共有 4 种颜色的荧光，这些荧光核酸链会是与探针上（gene-specific barcode 中）的某一截序列发生杂交。
杂交之后，被杂交的这个位置会在激发光的照射下就会发出相应颜色的荧光。并且，如前面所说的，探针是经过滚环复制的，所以一团探针（滚环复制产生的链）上会有几百个可杂交的位置。这几百个可杂交的位置都分别被荧光核酸链杂交上，那这个探针所在的位置发出的荧光强度就会增强几百倍。
经过一轮杂交之后，不同的探针就会分别发出 4 种颜色荧光中的一种荧光颜色，或者没有被杂交上的就不发荧光。
荧光显微镜把整个切片的各个位置荧光信号拍照留存，然后把第一轮的荧光核酸链洗掉。
接着用第二轮的荧光核酸链再次进行杂交，第二轮的荧光核酸链会针对与第一轮（杂交）不同的标签序列。切片上的探针被第二轮的荧光核酸链杂交之后，再拍照保留第二轮的杂交荧光信号。
然后再洗掉第二轮的荧光核酸链，接着再进行第三轮的杂交。
这样，经过若干轮的杂交之后，每个探针就会先后展现出一串特有的荧光编码。再经把原来设计的探针标签序列所应该应对的荧光编码，和拍照得到的实际的荧光编码进行比对，就可以知道切片上各个位置发出荧光的是哪一种探针，以及这个探针所针对的基因。最后就可以推断出切片上各个位置出现的是哪种基因的 mRNA，也就得到了原位的转录组的信息。
前面说了一种探针的情况，当同时用几百种基因的探针对样本进行检测，就可以得到这几百种基因在空间上的表达信息。
有空间表达的信息，再通过进一步界定细胞的边界，就可以得到单细胞的表达信息。
10X 公司对 Xenium 和 Visium 两种方法的结果进行比较，两者得到的结果有很好的趋势一致性。如果（某个基因）在 Visium 中是高表达的，那在 Xenium 当中（这个基因）也会是高表达的。
Xenium 对基因表达的检出灵敏度比 Visium 高 8～9 倍。
图中是对小鼠脑的 248 基因的 panel 的实测结果。一次实验可以测到 5400 万个转录本，每个细胞能检测到的基因数量的中位数达到 197 个基因，在这一张小鼠的脑的切片结果当中，通过无监督的细胞聚类可以检出 17 万个细胞。
因为 Xenium 分析当中只对样本切片做了微透化，所以对切片的损伤不大。因此做完 Xenium 分析的切片，还可以做 H&E 染色。
图中，中间是一个乳腺癌样本的 Xenium 的实验结果。左图是连续切片中紧挨着的一张切片，在没有经过 Xenium 实验时直接做 H&E 染色的结果。右图是做了 Xenium 实验之后的切片，再做 H&E 染色的结果。我们可以看到，没有经过 Xenium 实验的切片，和经过了 Xenium 实验的切片，它们的 H&E 染色的后的效果是很相近的。
从前面的原理上就可以知道， Xenium 的检测是需要预先设计好探针 panel 的。10X 公司目前提供了两个基础的探针 panel，一个是针对人乳腺癌的，有280个基因；另一个是针对小鼠大脑的，有 248 基因。
客户可以在基础 panel 上，再定制化地追加自己感兴趣的基因，最多可以加 100 个基因。
针对每个基因，平均是设计 8 种探针。这 8 种探针针对基因的不同的位置，这样设计可以在 mRNA 有部分降解的时候，mRNA 依然能够被检测到。
并且，在一个 panel 中，设计时还会对高表达和低表达的基因调整探针种类的数量，对高表达的基因减少探针种类的数量，对低表达的基因增加探针种类的数量，目的是要平衡对高表达基因和低表达基因检测的灵敏度，以免让高表达基因的信号掩盖了低表达基因的信号。
接下来 10X 公司还会推出更多的 panel，以方便客户的选用。
同时 10X 公司将来也打算把一次能够检测的基因数量，从 400 个基因提升到 1000 个基因。
Xenium 的仪器可以对得到的数据进行初步的分析，把得到的图片进行解码变成每个细胞中的目标基因的表达信息。
下机后的数据，可以用 10X 公司开发的专用软件做进一步的分析。
未来还可能出现第三方的软件对数据做更多的分析。
以上是介绍 Xenium 系统的全部内容。