TGEV（transmissible gastroenteritis virus）是造成猪腹泻的病原体，对许多国家的养猪业造成了严重的破坏。然而，目前对TGEV复制的分子机制仍不完全清楚。在本研究中，作者发现TGEV的M蛋白可与宿主细胞HSC70之间的相互作用继而以依赖网格蛋白介导的内吞方式来引导TGEV内化，揭示了TGEV复制的新机制。相关研究结果以题为‘The TGEV Membrane Protein Interacts with HSC70 To Direct Virus Internalization through Clathrin-Mediated Endocytosis’ 在线发表于国际高水平期刊 JOURNAL OF VIROLOGY。
首先，作者通过质谱实验分析发现可与M蛋白相互作用的HSC70蛋白，随后通过Co-IP实验进行验证，确定二者间可形成稳定的互作。激光共聚焦结果也进一步证实在TGEV感染后，M蛋白与HSC70存在共定位现象。对二者的相互作用模式进行分析，作者发现M蛋白是通过其胞内区（endodomain；134-264aa）与HSC70的受体结合区（RBD ）进行相互作用。
为了确定HSC70在TGEV复制中的作用，作者通过CRISPR/Cas9对HSC70进行敲除。发现HSC70敲除的细胞中TGEV N蛋白的表达水平低于WT 型细胞。此外，HSC70的敲除降低了病毒的生成。这一差异在12小时和24小时最具显著性，但在36hpi时没有观察到显著差异。这说明HSC70的敲除在早期阶段抑制了TGEV的复制。
作者发现HSC70与M蛋白的相互作用主要位于细胞表面，猜测M和HSC70之间的相互作用可能参与了病毒进入宿主细胞的过程。为了证实这一假设，作者首先进行了病毒附着和内化分析。结果显示，与WT 细胞相比，HSC70 KO的细胞中TGEV附着没有明显差异，但内化效率显著降低。其次，使用透射电子显微镜来监测TGEV的内化过程时发现在WT和HSC70 KO 细胞中，许多病毒颗粒附着在细胞膜上。在加入病毒30min后，在WT细胞上几乎没有观察到病毒颗粒，而在HSC70 KO 细胞中仍然观察到一些病毒颗粒，表明敲除HSC70降低了TGEV的内化。此外，作者发现阻断M蛋白与HSC70间的相互作用后可显著抑制TGEV的内化。
随后，作者发现M蛋白可与clathrin(网格蛋白)相互作用，且敲除clathrin会减弱TGEV的内化。但在HSC70敲除的细胞中，M蛋白与clathrin无法形成相互作用。说明TGEV是在HSC70的帮助下通过CME（clathrin-mediated endocytosis）途径内化。为了进一步阐明此现象的分子机制，作者进行了Co-IP实验探索HSC70是否与clathrin存在相互作用。结果表明，HSC70与clathrin存在相互作用。为了进一步阐明HSC70参与CME的具体机制，作者对HSC70的ATP酶活性进行抑制后观察对TGEV复制的影响。发现抑制HSC70的ATP酶活性后降低了CME效率，表明HSC70的ATP酶活性在TGEV内化中起着关键作用。
综上所述，本研究发现HSC70是一种参与TGEV内化的新宿主因子，TGEV M蛋白与HSC70的相互作用在TGEV的内化中起着重要作用。本研究表明，除了在病毒组装中发挥作用外，冠状病毒M蛋白在病毒进入细胞中也发挥着重要作用。因此，本研究强调了TGEV内化到细胞中的一种新机制。这些发现拓宽了我们对早期冠状病毒感染的理解。
本期编辑：小黄