撰文 | 孙丽 责编 | 周叶斌
急性髓细胞白血病（AML）的分子异质性使发展新型AML治疗变得复杂。尽管大多数个体在接受联合化疗后都有较为显著的治疗效果，但复发率达50%。复发后，同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）仍然是唯一的治疗方法；长期生存概率仍低于20%。因此，创新的治疗方案具有很大的医疗需求。
CAR-T已经成为治疗B细胞恶性肿瘤患者的有力选择，但由于缺乏安全有效的靶标，CAR-T细胞用于治疗AML尚未取得成功。目前，靶向AML相关靶抗原CD33和IL3RA（CD123）CAR-T细胞正在进行临床研究。其他靶标，如CD70、C型凝集素样分子-1，FLT3、CD44v6、Siglec-6或CD117已经作为替代CAR靶点进行临床前研究。然而在AML这样的髓系恶性肿瘤中，常见的靶标通常在其他重要组织上表达，增加了非肿瘤靶向毒性，因此，找寻安全目标结构，对于将具有巨大治疗潜力的CAR-T细胞应用于髓系肿瘤具有重大的意义。
近日，来自德国慕尼黑大学附属医院的科学家 Sebastian Kobold 带领团队在 Nature Biotechnology 上发表了题为 Single-cell transcriptomic atlas-guided development of CAR-T cells for the treatment of acute myeloid leukemia 的文章，作者对比分析15位AML患者和9名健康个体的超50万个单细胞的RNA测序数据，预测在恶性细胞上表达，但在健康细胞上不表达的靶标抗原。在高分辨率的单细胞表达数据的帮助下，作者应用生物信息学方法，发现CSF1R和CD86符合以上要求，可作为CAR-T细胞靶标，用于治疗AML。作者也对这些CAR-T细胞进行了功能验证：CAR-T细胞对体外和体内的AML模型，包括细胞系模型和人源AML模型，都显示出强大的治疗效果，对相关健康人体组织脱靶毒性极小。这为进一步的临床开发提供了有力的依据。
现有的肿瘤抗原脱靶研究多依赖于批量测序数据，缺少关于细胞类型特异性靶抗原表达模式信息的详细数据。近十年产生了大量的单细胞表达数据，可反映健康细胞和恶性肿瘤细胞的转录组的精确信息，这对于疾病治疗发展是未开发资源，比如在预测新的肿瘤细胞抗原和开发CAR-T细胞中，助于精确区分健康细胞和恶性肿瘤细胞，从而预测抗原是否靶向肿瘤。
因此，研究人员基于15个AML病人的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，从包含28000多个健康和恶性骨髓细胞的单细胞测序数据集中生成了转录组图谱，对这些数据进行了细胞表面分子表达分析，找到在恶性肿瘤细胞表面表达，但在人类健康细胞中（包括T细胞）最少表达的抗原。经过严格筛选，最终确定两个新的可用于治疗AML的CAR-T细胞的靶点：集落刺激因子1受体（CSF1R）和CD86。
通过生物信息学方法，逐步找到理想而又有效的CAR靶标抗原的工作流程。从图中可以看出，满足筛选条件的可以作为AML靶向基因的基因数量在逐步减少。
分析scRNA测序数据，筛选潜在的可用于治疗AML的CAR-T细胞的靶标（CSF1R和CD86）的具体流程。
作者接下来以CD123和CD33为对照，分析两种靶抗原CSF1R和CD86，比较它们在转录组中的表达水平。CSF1R在所有六个恶性细胞簇中都有表达，但在单核细胞样或常规树突细胞样簇中高表达。CD86是在单核细胞样、促细胞样和常规树突状细胞样簇中表达量最高（下图a）。在恶性HSPC簇中，CSF1R的表达量高于CD86，低于CD123和CD33参考基因（下图a，b）。相反，在健康的HSCs和祖细胞中可检测到CD123或CD33的表达，CSF1R和CD86在这些细胞中的表达都很低（下图b）。通过UMAP降维分析，可以非常直观的看到，CSF1R和CD86的表达谱与参考基因CD123和CD33相似（下图c）。
与健康的HSPCs相比，CSF1R和CD86主要在恶性HSPC样细胞上表达，肿瘤外表达仅限于在浸润或组织驻留的免疫细胞。
COOTA分析显示靶抗原主要表达在髓系来源的免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞），类似于CD33的外周表达谱（下图d）。CSF1R和CD86在上皮细胞上不高表达或基质细胞（下图d）。在器官特异性细胞簇中（下图d），表达仅限于大脑中的小胶质细胞。
接下来，作者使用六种不同的人AML细胞系和B细胞恶性NALM-6细胞作为阴性对照（下图e），评估在靶点抗原在蛋白质水平上的表达情况。。以CD123和CD33的表达作为参考，CSF1R和CD86在所有筛选的AML细胞系都有表达（下图e）。为了验证COOTA预测的转录组谱，作者使用流式细胞仪分析各抗原的受体在健康供体外周血免疫细胞上的表达。类似转录组预测，CSF1R和CD86主要在单核细胞上表达，在粒细胞或T细胞上没有表达。
虽然以上筛选过程非常严格，但CSF1R和CD86依然比临床中应用的靶向基因（CD19和BCMA）在组织中的表达更广泛。因此CSF1R相关CART细胞的安全需要严格把控。作者以EpCAM CART细胞、转导mCherry的T细胞为阴性对照，检测CSF1R CAR-T细胞在小鼠体内的潜在的脱靶毒性。
作者通过对小鼠进行CAR T过继细胞移植（adoptive cell transfer，ACT）来检测CAR T靶向毒性风险检测。T细胞移植后7天内，移植mCSF1R CAR T的小鼠体重并未发现明显变化，而移植对照mEpCAM CAR T的小鼠体重迅速下降，说明mCSF1R CAR T并未在小鼠体内引发毒性。
在mCSF1R CAR T细胞过继转移两周后，处死小鼠并检测小鼠体内各重要器官中CAR T细胞的比例，与mCherry-CAR T对照细胞相比，各组织中均含有更高比例的mCSF1R CAR T细胞，说明mCSF1R CAR T细胞具有更好的持续性或者抗原依赖性增殖。在肾脏，肝脏，肺中发现少量组织驻留CD11b+细胞，但后续的组织病理实验，并未发现mCSF1R CAR T细胞对小鼠的肺，肝脏，肾脏有非肿瘤靶向毒性。
为检测CAR-T细胞在大脑中的归巢和杀伤潜能，作者利用携带CX3CR1–GFP reporter的小鼠，通过TPLSM（two-photon laser scanning microscopy）可以直接看到CAR-T细胞与小胶质细胞的相互作用。
mCSF1R CART，mCherry-CAR T细胞通过皮下注射或者静脉注射至CX3CR1–GFP reporter小鼠体内，通过TPLSM监测28天内T细胞-小胶质细胞的相互作用，小胶质细胞形态变化，以及小胶质细胞数量的减少。注射CAR T前后小鼠体重或者行为上未有显著变化（下图k）；小鼠体内T细胞的数量在注射CART后有显著的升高，但在28天内，T细胞数量会显著下降；第28天后，小鼠体内检测不到移植的T细胞（下图l，o）；各CAR T细胞之间并未有显著差异（下图m，o）；在注射T细胞后，小胶质细胞的体积有所增加，可能由于胶质细胞的活化引起的，这种激活作用在注射mCSF1R CAR T细胞的小鼠中尤其明显，但在第28天后，这种激活作用会消失（下图n，o）；静脉注射T细胞后，并未在大脑中检测到T细胞，也没有检测到小胶质细胞的活化或耗尽。研究结果表明尽管靶抗原在不同固有免疫组织细胞和小胶质细胞中表达，但没有发现阻止其进一步临床治疗的发展相关的安全问题。
mCSF1R CART在CX3CR1-GFP报告小鼠中没有毒性
证明了CSF1R在各种同基因小鼠模型中的安全性后，作者接下来的目标是在人源肿瘤模型中验证CAR T细胞的靶标。作者将抗人CSF1R结合单链片段变体（scFv）克隆到先前存在的抗mCSF1R CAR主链中，这使得能够直接交叉比较小鼠和人类中抗小鼠和抗人CAR-T细胞的CAR-T细胞激活阈值。
所有CAR-T细胞产物（CSF1R CAR T、CD86 CAR T、CD33 CAR T）都可以有效地引入原代人类T细胞（下图a）。为了验证CD86 CAR T的功能并比较两种新开发的治疗方法的敏感性阈值，将两种CAR-T细胞与其各自的板结合抗原一起孵育（下图b）。在非常低浓度的靶蛋白（0.01μg ml-1）下已经观察到CD86 CART的激活。相比之下，hCSF1R-CART需要1μg ml-1或更高的浓度（下图b）。作者将所有CAR-T细胞与AML细胞系共培养，并评估AML细胞的特异性裂解和抗原依赖性增殖（下图c，d）。hCSF1R和CD86 CART有效地裂解了所有六种AML细胞系，与CD33 CART相当（下图c），并增殖到类似的程度（下图d）。CD19 CAR-T细胞（CD19 CART）被用作对照转导的细胞。
抗靶向CAR-T细胞可快速有效得在体外裂解AML细胞系
为了证明新开发的CAR-T细胞在小鼠体内疗效，作者给NOD-scid Il2rg-null（NSG）小鼠注射致死剂量的Mv4-11 AML细胞，并注射CAR T细胞（hCSF1R、CD86、CD33或CD19（对照））（下图e）。使用生物发光成像（BLI）监测肿瘤进展。hCSF1R和CD86 CART在体内都消除了Mv4-11肿瘤负荷（下图f–h）。为了提供另一种AML模型的体内证据，作者将致命剂量的THP-1细胞静脉注射到NSG小鼠中，并用CSF1R、CD33或对照CAR T处理它们（下图e）。同样，hCSF1R-CAR T有效地控制了实验性白血病，其完全缓解（CR）率与CD33 CART相似，肿瘤细胞注射后总生存期可达80天（下图i–k）。
上述结果在体外和体内证明新开发的hCSF1R和CD86 CAR T对大量人类AML细胞系的疗效。
靶向CAR-T细胞可快速有效得在体外裂解AML细胞系
作者接下来评估了原发性AML样本中的受体表达。分析刚刚解冻的骨髓样本细胞表面的CSF1R表达时，作者无法通过流式细胞分析检测到该受体的表达（下图a、b）。然而，当原代AML细胞在MS-5小鼠骨髓基质细胞上共培养时，可观察到CSF1R的表达随时间增强（下图a、b）。作者还证实了CD86在原发性AML母细胞上的表达（下图c）。
接下来，作者将原代AML样品与CAR-T细胞共培养，并通过流式细胞仪分析并确定特异性裂解。在低E:T比率下，hCSF1R和CD86 CART细胞可特异性裂解原发性AML样品，与CD33 CAR T相当的（下图d）。考虑到AML的遗传异质性，作者使用具有不同细胞遗传学的七个不同的原发性AML样本进行实验。为了探索新的抗靶CAR是否可以引入来源于AML个体的T细胞，作者将抗hCSF1R-CAR构建体转导至患有AML的个体的T淋巴细胞中（下图e）。然后将人来源的hCSF1R-CART与自体原代AML母细胞共培养，发现原代细胞可被有效裂解（下图f）。
在原发性AML样品上容易检测到CSF1R和CD86，并且hCSF1R-CART在体外和体内显示出对原发性ALL细胞的有效裂解。
为了证明hCSF1R和CD86 CART在更相关的体内模型中的疗效，作者将细胞遗传学上不同的人源性异种移植物（PDX）模型移植到小鼠中，并用相应的CAR-T细胞处理。在三种不同的细胞遗传学PDX模型和三种细胞系异种移植模型，作者能够在体外和体内提供CRSF1 CAR-T细胞功能的有力证据。
综上，作者利用单细胞测序数据，通过对比分析，筛选到两个可能有效的治疗AML的CAR T靶标分子，CSF1R和CD86。作者应用AML疾病模型，开展了一系列体内体外实验，证实CSF1R和CD86在AML原始细胞中有广泛的表达，对AML肿瘤样品展示持久的强烈的有效性，对健康细胞组织有极小的非靶向肿瘤毒性。本文的研究不仅说明单细胞测序数据对于疾病研究是一份宝藏，也为进一步的临床开发提供了有力的依据。
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