编者按：随着抗菌药物的广泛应用，临床上出现越来越严重的抗菌药物耐药现象。为遏制抗菌药物滥用，通常需要药敏结果来指导临床用药。然而，常规药敏检测方法耗时长，难以满足临床快速诊治的需求，因此迫切需要研发快速药敏检测方法。在第33届欧洲临床微生物学与感染病学大会（ECCMID 2023）中，多项研究聚焦了广泛耐药菌的药敏耐药检测问题。
01
体外时间-杀菌试验：黏菌素联合用药有助于克服肺克菌异质性耐药
黏菌素几乎是治疗多重耐药（MDR）革兰氏阴性菌感染的最后一种抗生素。然而，异质性耐药现象仍然是临床面临的一个持续存在的问题，即少量的耐药细菌亚群在黏菌素治疗下得到扩增，进而导致治疗失败。本研究筛选了对黏菌素有异质性耐药的肺炎克雷伯菌，以评估抗生素联合在体外减少其耐药亚群再生的潜力。
本研究调查了从六个欧洲国家不同医院ICU收集的对黏菌素敏感的肺炎克雷伯菌分离株（n=55）。采用菌落谱型分析（PAP）试验对分离株进行测试，以确定黏菌素的异质性耐药表型。在进行时间-杀菌试验时，将抗生素浓度调整到近似接受标准高剂量（严重感染）治疗患者的血清峰值水平（黏菌素[C]，2 mg/mL；替加环素[T]，1 mg/L；阿米卡星[A]，64 mg/L；庆大霉素[G]，16 mg/L；美罗培南[M]，23 mg/L；亚胺培南[I]，26 mg/L），并加入到细菌菌落总数大约在106 CFU/mL的处于对数生长期的肉汤细菌培养基中。
在测试的55个对黏菌素敏感的菌株（MIC≤2）中，发现3个（6%）MDR菌株对黏菌素具有异质性耐药，分别为AN1505、IT0244、IT0035（表1，图1）。时间-杀菌试验结果显示，黏菌素单药无法完全抑制异质性耐药菌株中耐药亚群的生长（图2A）。相反，在C+A、C+T、C+M和C+I联合用药组，异质性耐药菌株的菌落数量随着时间的推移迅速减少。即使在24小时后，除了C+G组的AN1505菌株外，其他菌株均未出现耐药亚群再生（图2B～2F）。
表1. 测试菌株对各种抗生素的敏感性
图1. 测试菌株的PAP试验结果
图2. 黏菌素单药和联合用药的时间杀菌曲线
结论：除C+G组外，其他抗生素组合（C+A、C+T、C+M、C+I），在体外时间-杀菌试验中均能有效预防或减少已确定的黏菌素异质性耐药菌株出现的新耐药亚群。这些抗生素组合有望预防黏菌素单药治疗可能出现的治疗失败，但这仍需在临床进一步评估。
02
一种快速药敏试验：数字化黏菌素药敏试验的简易菌株包埋技术
开发高效的快速药敏试验（AST）工具对于防止耐药菌的传播至关重要。对碳青霉烯类具有耐药机制的菌株尤其具有威胁性，感染这些细菌的患者通常使用黏菌素治疗。然而，自2016年以来，对碳青霉烯类和黏菌素均耐药的菌株出现，也导致了治疗失败。为了对感染多重耐药菌的患者进行有效治疗，需要有快速的方法来确定感染细菌对黏菌素的药敏谱。
研究者开发了一个简单的微流控平台，使用梯度封闭法将5种临床分离株（大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）同时封装在1.4 nL的单分散液滴中，并在多个储存室中生长（～3000液滴/室）。芯片封装前，在细菌溶液中补充黏菌素，以达到0、1、2和4 µg/mL的最小抑菌浓度折点（图1）。采用基于明视野图像和自动图像分析来检测细菌的生长并确定药敏谱。
图1. 芯片细菌生长检测流程图
将来自临床分离株的细菌菌株封装在液滴中。测量细菌液滴占比（含有细菌的液滴占液滴总数的百分比），当使用不同初始浓度的细菌时，结果与预测值完全一致，以评估该方法的灵敏度。研究者在2小时后检测到细菌生长，与标准微量肉汤稀释法（BMD）相比，应答时间缩短了10倍。在5个测试菌株中，1个是敏感菌，4个是耐药菌，与BMD结果一致。
结论：该方法用于在2小时内对黏菌素进行药敏测试，不考虑所涉及的耐药机制。所得结果与AST的参考方法一致，表明该方法是准确和快速的。未来将测试更多的敏感和耐药菌株，并使用被感染的生物液体进一步验证该方法。
03
通过流式细胞术直接从血培养阳性标本中快速测定黏菌素MIC
在一些国家，黏菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性杆菌的最后防线药物。它的使用因地区而异，考虑到大多数自动化系统的准确性问题，MIC的测定是存疑的。微量稀释法是推荐的方法，但操作繁琐，在标准方案下需要2天才能提供血培养阳性的结果。FASTinov®开发的流式细胞仪FASTcolistin MIC在对纯菌落进行检测时显示出极好的准确性。本研究直接从血培养阳性标本中评估了其性能。
共评估了71个血培养：66个来自葡萄牙波尔图大学中心医院的血培养阳性标本（2022年2月至5月），标本依次获得（只有一个来自同一患者）；此外，还包括5个ATCC标准菌株（大肠杆菌ATCC 13846 [mcr1阳性]、大肠杆菌25922、肺炎克雷伯菌13443、肺炎克雷伯菌700603和大肠杆菌8739）。根据使用说明进行样品制备，最多需要5分钟获得清洁的细菌悬液。然后接种含有0.25 mg/L～64 mg/L黏菌素浓度的FASTcolistin MIC板并培养1小时，接着进行流式细胞仪分析（DxFlex，Beckman Coulter，美国）。使用专有软件报告MIC，并与通过微量稀释法确定的标准MIC进行比较。计算基本一致性和偏倚（ISO20776-2）。对10个菌株进行重复性测试。
患者的血培养结果包括29个大肠杆菌、21个克雷伯杆菌属、3个奇异变形杆菌、3个沙雷菌属、1个摩氏摩根菌、1个成团泛菌、1个阿氏肠杆菌和7个铜绿假单胞菌。图1显示了通过流式细胞仪和标准方法获得的每个标本的MIC值。一致性为100%，偏倚为12.6%。重复性为98.1%。
表1. 最小抑菌浓度分布
结论：FASTinov®开发的FASTcolistin MIC试剂盒具有很好的准确性，不仅可以从菌落进行检测，而且可以直接从血培养标本进行检测，仅用2小时就可以得到结果，比标准方法的2天快很多。
▌参考文献：
[1]S.G. Rajakani, B.B. Xavier, C. Lammens, et al. Evaluation of various antibiotic combinations by in vitro time-kill assays against colistin-heteroresistant Klebsiella pneumoniae. ECCMID 2023, abstract O0779.
[2]J. Riti, G. Sutra, H. Volland, et al. Facile bacterial encapsulation for digital antimicrobial susceptibility testing of colistin. ECCMID 2023, abstract O0785.
[3]D. Fonseca E Silva, S. Cruz, R. Gomes, et al. Rapid colistin MIC determination by flow-cytometry directly from positive blood cultures. ECCMID 2023, abstract O0786.