本期荐读丨重现经典科学实验，落实学科核心素养——模拟“希尔反应”/张宁等

生物学通报

2023-06-02 17:11生物学通报官方账号

文章来源：张宁,郭秋荣,任丹丹,王镤加. 重现经典科学实验，落实学科核心素养——模拟“希尔反应”[J]. 生物学通报, 2023, 58(5): 45-48.

编者按

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本刊2023年第5期刊发的《重现经典科学实验，落实学科核心素养——模拟“希尔反应”》一文，探索了提取叶绿体的方法，确定了氧化剂与叶绿体悬浮液的反应比例，成功模拟了教材中的“希尔反应”，是一篇很好的教学实验类文章，本期荐读。

重现经典科学实验，落实学科核心素养

——模拟“希尔反应”

张宁任丹丹王镤加（首都师范大学附属回龙观育新学校)

郭秋荣 ( 北京市昌平区教师进修学校)

摘要

叶绿体悬浮液在有 H2O、无 CO2 的条件下发生希尔反应，说明水的光解产生了 O2，利用此反应可以“探究光合作用的氧气来源”。本文摸索了提取叶绿体的方法、确定了氧化剂与叶绿体悬浮液的反应比例，且通过调 pH、自制实验装置创造了无CO2的反应环境，成功模拟了教材中的“希尔反应”。最终确立的操作步骤简单易行、实验现象明显直观，使学生能在动手实践过程中发展科学探究能力。这一研究为高中生物学教学提供了很好的实验教学资源。

关键词

希尔反应实验教学核心素养

教育部发布的《关于加强和改进中小学实验教学的意见》提出，实验教学是培养创新人才的重要途径。《普通高中生物学课程标准（2017 年版 2020 年修订）》教学建议中提出，要加强和完善生物学实验教学，要注重生物科学史的学习。由此可见开展实验教学研究的重要性和必要性。

“希尔反应”是高中生物学必修 1《分子与细胞》第 5 章“探究光合作用原理”科学史中的重要内容。该实验说明水在光下被分解产生 O2，同时也表明 O2 的产生和糖类的合成不是同一个化学反应，划分出光反应和暗反应 2 个阶段。但由于该实验操作繁琐、试剂比例确定困难、实验条件难以控制、实验过程中生成性问题复杂等原因，教材中并未对此实验的细节加以介绍，也没有安排开展相应的实验教学活动。只停留在实验分析上的学习，不利于充分发展学生的生物学学科核心素养。

因此，笔者带领学生进行实践创新，经过不断摸索探究，成功提取出了菠菜叶绿体，将其调 pH 至 8.4 后，与一定比例的氧化剂（1% 2，6-二氯酚靛酚）在 2 个胶管连接的、排净空气的注射器中反应。这个装置成功排除了 CO2的影响，将教材上利用“希尔反应”探究“光合作用 O2来源”的科学史资料转变成实践活动，重现经典科学实验，落实学科核心素养。

实验原理

希尔反应是指离体的叶绿体在适当条件下发生水的光解、产生 O2，同时将加入的氧化剂或电子受体（高铁盐）还原的过程。利用希尔反应可以“探究 O2 的来源”，叶绿体悬浮液在有H2O、无 CO2 的条件下发生希尔反应，说明水的光解产生了 O2。

氧化剂 2，6-二氯酚靛酚（DCPIP/2,6-D）是一种蓝色染料，接受希尔反应产生的电子和 H+ 后，被还原为无色（图 1）。通过直接观察颜色变化，或者进一步用分光光度计测定反应前后吸光度的变化，可以定性观察或者定量测定希尔反应。

实验过程

2.1 材料和器具

实验材料和试剂：新鲜的菠菜，0.4 mol/L 蔗糖，0.05 mol/L Tris，0.01 mol/L NaCl，HCl，0.1% 的2，6-二氯酚靛酚（用叶绿体提取液溶解、避光保存），0.1 mol/L 草酸铁（避光保存），1％的酚酞（1 g酚酞溶于100 mL 95％的乙醇中），1 mol/L的NaOH溶液等。

实验器具：离心机、天平、剪刀、离心管、研钵、纱布、锥形瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、电子pH计、载玻片、盖玻片、显微镜、5 mL 注射器、橡胶管、移液器等。

2.2 实验步骤

2.2.1 制备离体叶绿体悬浮液

首先，配制与叶绿体等渗的叶绿体提取液（将13.69g 蔗糖、0.058gNaCl 和0.606gTris溶于100 mL 超纯水中，用 HCl 调pH 至 7.6）；选用新鲜的菠菜叶片，用剪刀去除主脉，超纯水洗净擦干，称取12 g放入冰浴过的研钵中；加入15mL 预冷的叶绿体提取液，以及少量石英砂，在研钵中快速研磨 1 min，继续加入10 mL 预冷提取液，研磨 30 s，注意研磨不要过于用力，以不连续研磨和把叶片磨成小块为宜；研磨成匀浆后，用 4 层纱布过滤于烧杯中；滤液用1000 r/min 离心 2 min，弃去沉淀，收集上清液；上清液用 3000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，沉淀即是叶绿体；最后，用 20 mL 提取液悬浮沉淀，置于冰浴备用，或者暂时存放 4℃冰箱中（经检验，10 h 后依然存在活性）。需要注意，为了保持叶绿体活性，提取过程应迅速，尽量在冰上操作，以保持温度 0~4℃。提取用的研钵、提取液等都应在冰上预冷。

2.2.2模拟希尔反应探究O2来源

希尔反应只有在无 CO2 的条件下进行，才能证明水的光解产生 O2，进而初步验证 O2 的来源。利用碱中和法，用 1 mol/L 的 NaOH 调叶绿体提取液的 pH 至 8.4，可使反应液中无游离 CO2。在此基础上，采用以下装置进行反应（图 2），可最大限度地保证反应装置中无空气，排除整个体系中CO2的干扰。

实验结果和结论

反应 5 min 后进行观察，遮光组无明显变化，而照光组的离体叶绿体悬浮液由深蓝绿色变浅绿色，且产生细密的气泡（图 3）。说明离体叶绿体在光照下发生希尔反应，把蓝色的氧化型 2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型 2，6-二氯酚靛酚。由此可以得出结论，离体叶绿体在光照下使 H2O 发生光解，产生 O2，推测光合作用产生的 O2可能来源于水。在课堂教学中，需要进一步分析鲁宾和卡门实验，以进一步验证O2来源。

实验过程中遇到的问题和解决方案

4.1 叶绿体的提取

不同的文献和资料中提取叶绿体的方法各不相同，主要涉及材料选取、提取液配制、物料比的控制，以及最终稀释比例等问题。此外，文献中对离心（转速控制、离心时间甚至取上清液还是沉淀）的描述差别较大，对探究过程造成一定的干扰。经过大量的实验对比，尝试了菠菜和小白菜、磷酸盐缓冲液和 Tris-HCl 缓冲液、不同转速和时间、取上清液和沉淀等，并经过显微镜镜检（图 4）和实验，最终确定了提取方案和稀释比例。由图 4 可知，“先 1000 r/min 离心取上清液，再 3000 r/min 离心取沉淀”的方法可以有效提取出叶绿体（图 4-a、b），考虑到用量和反应效率，最后选用 20 mL 提取液悬浮叶绿体。

4.2 创造无CO2的环境

如何去除CO2是“通过模拟希尔反应验证氧气来源”的关键。针对这个问题，尝试用碱性溶液（石灰水/NaOH）吸收空气中 CO2的化学方法，以及用注射器抽空气的物理方法，但前者不能完全吸收反应液中的 CO2 ，后者不仅去除不完全，且对叶绿体造成损伤。

经查阅文献发现，在现行的水质化验分析中，水中游离CO2的测定采用 SL80—1994《中华人民共和国行业标准》。该方法属于碱中和滴定法，原理为：用 NaOH 滴定溶液中 CO2，可发生如下反应：

CO2＋NaOH＝NaHCO3，

H2CO3＋NaOH＝NaHCO3＋H2O。

当其达到滴定终点时，溶液的 pH 约为 8.3，即可用 pH 判定游离 CO2 的存在。

反应液中的氧化剂 2，6-二氯酚靛酚呈碱性，菠菜叶绿体悬浮液则因为样品和提取条件的不同，检测出的pH范围为8.0~8.3。只需将其用NaOH调pH至8.4，即可保证反应液中无CO2。至此，只需让反应容器里无空气即可。本研究采用 2 个注射器连接的装置（图 2）,只要注射器先排尽空气，吸取时避免吸入空气，就可以避免外界 CO2 混入。用pH 8.4 的叶绿体提取液与酚酞反应模拟实验，对装置进行检测，发现反应体系中的 pH 可以维持在使酚酞变色的范围内（图 5-a），表明反应环境中无 CO2。值得注意的是，调 pH 对叶绿体的活性是有影响的。将叶绿体悬浮液的 pH 从 8.0 调至 8.4 再进行反应，可观察到反应效率明显降低（图 5-b）。

4.3 选用氧化剂

能作为希尔反应电子和氢受体的为希尔氧化剂。常见的有：2，6-二氯酚靛酚、草酸铁、高铁氰化钾、苯醌、NADP+ 、NAD+ 等。本实验中尝试了0.1%的 2，6-二氯酚靛酚和0.1 mol/L 的草酸铁。经测试，加入草酸铁产生的气泡相对于 2，6-二氯酚靛酚快且多，但无明显的颜色变化（图 6）。教师可以根据实验需要适当选用这 2 种氧化剂。

4.4 确定叶绿体悬浮液和氧化剂的用量比例

氧化剂 2，6-二氯酚靛酚呈深蓝色，如果氧化剂过多，即便发生反应，也观察不出颜色变化，且气泡不容易观察；如果氧化剂过少，则颜色对比不够明显。此外，还需要有一个适宜的反应时间，不能太慢或太快，因此，控制氧化剂和叶绿体悬浮液的用量比例十分重要。

设计系列比例梯度的实验进行结果对比。2.5 mL 叶绿体悬浮液分别与100、150、200、250 μL 的 0.1% 2，6-二氯酚靛酚组合反应。结果发现，加入 100 μL 2，6-二氯酚靛酚颜色变化不明显；加入 250 μL 虽然产生气泡，但未有明显的颜色变化（图 7-a）；则最佳比例以 150~200 μL 2，6-二氯酚靛酚为宜，此区间变色比较显著，且气泡比较明显。在 150~200 μL 内进一步设置梯度，最终选定 2.5 mL 叶绿体悬浮液（按本提取方法中的稀释比例）与 170 μL 0.1% 2，6-二氯酚靛酚反应。在将 pH 由 8.0 调至 8.4 的情况下，此比例反应前后颜色对比显著，且气泡最容易观察（图 7-b、图 3）。如果 pH 需要调的程度不大（如由 8.2 调至 8.4），则采用 2.5 mL 叶绿体悬浮液与200μL0.1% 2，6-二氯酚靛酚反应最佳（图 7-b）。此外，将反应时间增加到 10~ 15 min，气泡更容易观察。