撰文 | 许枫 责编 | 周叶斌
神经母细胞瘤是最常见的儿童颅外实体瘤，高危患者的预后较差，是可致命的儿童癌症。家族性神经母细胞瘤患者多数带有遗传性的ALK（anaplastic lymphoma kinase, 间变性淋巴瘤激酶）突变。ALK是一种在神经组织中表达的受体酪氨酸激酶，通过RAS-MAPK和PI3K-AKT通路激活。已知14%的高危神经母细胞瘤携带体细胞的ALK突变，在复发患者中该比例更高。ALK突变主要集中在酪氨酸激酶结构域的3个热点位置：F1174、F1245和R1275。这些发现使得ALK成为神经母细胞瘤里靶向治疗的重点研发方向。
尽管一代ALK抑制剂克唑替尼在很多有ALK融合基因的肿瘤里有治疗效果，但在复发或难治的带有ALK驱动的神经母细胞瘤中，效果却差强人意。研究表明第三代抑制剂劳拉替尼可以克服神经母细胞瘤中ALK突变产生的耐药性。例如作为单药，劳拉替尼在神经母细胞瘤患者来源的异种移植模型临床前试验中，展现了对ALK抗性突变的有效性。
近日，费城儿童医院 Dr. Moss 团队在Nature Communications发表了题为 Circulating tumor DNA reveals mechanisms of lorlatinib resistance in patients with relapsed/refractory ALK-driven neuroblastoma 的文章，阐明了复发或难治的神经母细胞瘤里劳拉替尼耐药的遗传机制，包括RAS-MAPK通路上的非靶向耐药突变（27%），以及疾病进展期间新产生的ALK复合突变（15%）。研究也证实了，临床上可以用肿瘤循环DNA来追踪药物响应以及探索耐药机制，该发现为克服劳拉替尼耐药性制定治疗新策略奠定基础。
该研究共有41个病患有至少一个cfDNA采样。作者先根据cfDNA里检测到的ALK突变丰度以及病患对劳拉替尼治疗的响应程度，对样本分为以下三组：
第一组为ALK依赖组 （51%, 21/41）（图1a），该组ALK突变的丰度与治疗响应结果相关联。丰度随着劳拉替尼的临床响应而减少或者稳定，或者随着疾病进展而增加。
第二组为ALK独立组（27%, 11/41）（图1b）。该组病患的cfDNA的ALK突变丰度与治疗响应没有关联。一些病患即使疾病进展了，但ALK突变的丰度减少，这可能由于肿瘤的异质性和一些没有ALK突变的亚克隆的过度增长而引起的。比如27号病患被检测有低丰度的ALK F1174L （VAF=0.32%）， NF1 E163* （VAF=32.8%）和MYCN基因扩增突变。随着疾病的进展，相对应的cfDNA中只检测到了NF1的突变和MYCN基因扩增。ALK突变在该样品中缺失。而劳拉替尼在该病人的临床治疗响应结果较为复杂，一些软组织肿瘤完全消失而一些更恶化了，且ALK突变在恶化的肿瘤里都未被检测到。结果建议在该病人的劳拉替尼治疗中，抗性来自于非ALK突变的克隆。
第三组为cfDNA样本中检测不到ALK突变 （20%, 8/41）(图1c)。
图1. cfDNA中的ALK突变丰度和临床治疗响应的对应关系。红色代表疾病进展。蓝色代表最小程度治疗响应或部分响应。绿色代表完全响应。圆圈大小代表ALK突变丰度量。
作者进一步筛查获得抗性的遗传驱动基因，从而发现由非靶向突变带来的抗性机制。作者在11个病患的系列cfDNA样本里（27%）检测到非靶向突变，这些突变都是随着疾病进展而产生的（图2红色）。在12个病患中检测到RAS-MAPK/PI3K下游通路的基因突变。（图3）。比如2，13，14号的PTPN11 或者BRAF突变在治疗前的cfDNA样本中没有，但在随后采集的cfDNA中被检测到，表明这些突变随着治疗而在不同阶段产生。该结果证实了对于进行ALK靶向治疗的病人，用系列的cfDNA样本分析可以在疾病进展前或进展期找到其他可靶向治疗的目标。
图2. 病例在疾病治疗中检测到的基因突变分布图
图3. 个别病例在疾病进展后被检测到的特定通路下游的基因突变分布图
作者还在样本中检测到ALK复合突变， 揭示了由其产生的耐药性机制。有六位病患被检测到ALK在酪氨酸激酶结构域位置上的二次突变（图4）。第二个ALK的突变都是在劳拉替尼治疗初期响应后出现的， 且都伴随着疾病进展。作者在细胞系里测试这些突变，证实了复合ALK突变可以导致耐药性（图5）。为阐明耐药性产生机制，作者对纯化的ALK酪氨酸激酶结构域进行了体外的生化试验，复合ALK突变直接降低了劳拉替尼的敏感性。作者接着用分子动力学建模来模拟复合突变（F1174L/L1196M, F1174L/G1202R, R1275Q/L1196M, 和R1275Q/G1202R）对该结构域的影响。分析表明不同位点的复合突变对劳拉替尼的耐药性产生机制不同。
图4. ALK复合突变与肿瘤抗性及疾病进展相对应。不同颜色圆圈代表疾病状态及对劳拉替尼响应程度。
图5. 体外对ALK复合突变的细胞及生化学研究
图6. 由ALK复合突变引起的劳拉替尼抗性机制的结构模型
综上所述, 作者通过对病例的一系列cfDNA分析，揭示了新产生的ALK二次突变或是RAS-MAPK通路上的基因突变是ALK驱动的神经母细胞瘤病患对劳拉替尼产生耐药性的原因。至于靶向RAS通路上的基因的抑制剂是否能预防疾病复发和针对ALK抑制剂的耐药性有待进一步研究。该结果进一步证明了液体活检在临床上对疾病监控及治疗策略选择上可以起到重要作用。
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排版 | Sheila 校对 | uu