EASL中国之声丨北京大学肝病研究所7项成果闪耀2023欧肝会

2023年6月21日～24日，一年一度的肝病学国际盛会——第58届欧洲肝脏研究学会年会（EASL2023）暨2023年EASL大会（EASL Congress 2023）在奥地利维也纳隆重举行。今年中国专家学者有百余篇研究摘要入选大会交流，其中来自北京大学人民医院、北京大学肝病研究所的团队，围绕脂肪肝、肝癌、慢性乙型肝炎和原发性胆汁性胆管炎领域，喜获7篇poster展示。具体研究摘要分享如下，《国际肝病》带您一睹团队风采。

SAT-124: Multiple vitamin co-exposure and mortality risk in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease

代谢相关性脂肪性肝病（Metabolic-associated fatty liver disease，MAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性相关的慢性肝病，影响了全球约1/4的人口，给社会带来了巨大的公共健康问题。越来越多的研究探讨了维生素与MAFLD的关系，提示维生素水平可能影响疾病进展结局，但结果仍然存在争议。因此，多种维生素共同暴露对MAFLD的影响值得进一步研究。

采用1988～1994年国家健康和营养检查调查（NHANES-III）及其关联死亡随访数据。MAFLD定义为超声诊断的肝脏脂肪变性，并且同时满足以下三项条件之一：超重或肥胖、2型糖尿病、代谢功能障碍。K值聚类确定多种维生素共同暴露模式。采用Logistic回归模型分析患病风险（OR）。采用Cox比例风险模型分析全因死亡率和特异性死亡率的风险比（HR）。

多因素Logistic回归分析显示较高水平维生素水平可以降低MAFLD患病风险。较高水平维生素可以降低全人群的全因死亡率。较高水平的维生素A和维生素D水平可以降低MAFLD患者的全因死亡率，较高水平的维生素D水平可以降低MAFLD患者的心血管和癌症死亡率。

较高水平的维生素共同暴露可以适当降低MAFLD患病风险，较高维生素D水平可以降低MAFLD患者的全因、心血管和癌症死亡风险。

WED-125：IP10 and anti-HBc can predict virological relapase and HBsAg loss for chronic hepatitis B patients after nucleos (t)ide analogue discontinuation

慢性乙型肝炎（CHB）患者停用核苷（酸）类似物（NA）后病毒学复发（VR）的风险以及能否获得HBsAg转阴一直是存在争议的话题。本研究通过建立HBeAg阳性CHB患者停用NA的队列，评估干扰素诱导蛋白10（IP10）和抗-HBc对于停用NA后的病毒学复发及HBsAg转阴的预测能力。

2017年1月～2020年12月，在京津冀共12家医院，前瞻性纳入139例开始抗病毒治疗时为HBeAg阳性、符合中国《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）停药标准的CHB患者（HBV DNA<20 iu />L、ALT正常、HBeAg血清学转换后，再巩固治疗至少3年，NA的总疗程至少4年）。患者加入研究时停用NA，在停药后每3个月随访一次，共随访至停药后24个月或临床复发时研究终止。收集患者临床数据，采集临床标本，统计停药后的VR率和HBsAg转阴率，分析IP10和抗-HBc的预测能力。

停药时（EOT）的IP10和抗-HBc分别为29.2（5.1～66.4）pg/mL和193.6（136.9～221.4）IU/mL。Cox回归分析结果显示EOT IP10［危险比（HR）0.976，P<0.001］和抗-hbc（hr 1.011，p<0.001）是停药后vr的独立预测因素；eot ip10（hr 1.026，p<0.001）也是停药后hbsag消失的独立预测因素。< />>

停药后24个月，EOT IP10>26.99 pg/mL和≤26.99 pg/mL的患者累积VR率分别为31.9%和70.1%（HR 2.998，P<0.001）。eot抗-hbc≤141.35 iu />L和>141.35 IU/mL的患者累积VR率分别为49.1%和60.6%（HR 2.99，P<0.001）。eot ip10>26.99 pg/mL并且抗-HBc≤141.35 IU/mL的患者累积VR率为16.7%，显著低于73.6%（HR 6.464，P<0.001）。< />>

停药后24个月，EOT IP10>93.5 pg/mL和≤93.5 pg/mL的患者累积HBsAg消失率分别为46.2%和4.7%（HR 10.94，P<0.001）。eot抗-hbc≤78.42 iu />L和>78.42 IU/mL的累积HBsAg消失率分别为47.1%和5%（HR 12.27，P<0.001）。eot ip10>93.5 pg/mL并且抗-HBc≤78.42 IU/mL的患者停药后24个月的累积HBsAg消失率最高（53.8% vs 4%，HR 16.83，P<0.001）。< />>

停药时IP10越高、抗-HBc越低，停药后VR风险越低、HBsAg消失概率越高。

WED-438: Collagen co-localized with macrovesicular steatosis better differentiates fibrosis progression in non-alcoholic fatty liver disease mouse models

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种全球性的常见肝病。然而，其确切的发病机制尚不完全清楚，并且目前仍缺乏上市的治疗药物。在NAFLD的研究中，存在获取人体肝脏样本的局限性，因此有必要建立动物模型来研究人类NAFLD的不同致病机制和治疗靶点。既往二次谐波（SHG）/双光子激发荧光成像（TPEF）技术被报道用于定量评估肝脏脂肪变性和纤维化。本研究拟应用该方法评估NAFLD动物模型中脂肪变性和纤维化的分布、形态和共定位，定量评估肝脏病理特征的进展。

本研究建立了6种NAFLD小鼠模型，包括：①西方饮食（WD）组；②WD加果糖饮水组（WDF）；③WDF+四氯化碳（CCl4）组：WDF加腹腔注射CCl4；④高脂饮食（HFD）组；⑤HFD加果糖（HFDF）组；⑥HFDF+CCl4组，HFDF加腹腔注射CCl4。在不同喂养时间点收集NAFLD模型小鼠的肝组织样本。所有肝组织进行连续切片，并进行组织染色和二次谐波（SHG）/双光子激发荧光成像（TPEF）分析。使用SHG/TPEF定量分析脂肪变性和纤维化，并与NASH-CRN系统评分进行比较。

qSteatosis参数与NASH-CRN系统的脂肪变性评分呈正相关（R：0.823～0.953，P<0.05），这种相关性在六种小鼠模型均具有较好的一致性（auc曲线下面积：0.617～1）。基于它们与组织学评分的高度相关性，选择包含四个参数（#longstrps、#thinstrps、#tinstrpsagg和#longstrpsdis）的qfibrosis来创建一个线性模型，该模型可以准确识别不同纤维化等级之间的差异（auc：0.725～1）。此外，研究发现与大泡脂肪变共定位的qfibrosis与nash-crn评定的肝纤维化评分更为相关，这种相关性在六种动物模型中均具有较高的auc值（auc=0.846～1）。< />>

应用SHG/TPEF技术对肝脏病理定量评估可用于监测NAFLD模型中不同类型的（大泡和小泡）脂肪变性和纤维化进展。与大泡脂肪变共定位的胶原可以更好地区分纤维化进展，并可能有助于为NAFLD动物模型研究开发更可靠和用于转化的纤维化评估工具。

SAT-235: PSMP inhibits HCC progression by regulating the polarization of tumor-associated macrophages via the PI3K/Akt pathway

世界范围内，原发性肝细胞癌（HCC）是最常见的高发病率、高致死率的恶性肿瘤之一。HCC具有发病隐匿、高异质性、高转移性和易复发性等特征，导致其治疗效果不佳，预后较差。PC3分泌的微蛋白（PC3-secreted microprotein，PSMP）是由北京大学王应教授课题组通过全基因组生物信息学分析和趋化因子筛选平台发现的一种新趋化活性细胞因子，能够趋化人外周血单核细胞和淋巴细胞，其功能受体为CCR2。我们的前期研究在国际上首次发现PSMP在不同病因诱导的人和小鼠肝纤维化和肝硬化组织中显著高表达；PSMP可通过调节肝脏巨噬细胞的浸润、活化和极化来促进肝纤维化的进展。然而，目前PSMP与HCC的发展及预后的关系尚不明确。

在两个独立的HCC患者队列中检测PSMP的表达，并分析其表达水平与患者预后的相关性。体内实验：在PSMP基因敲除和野生型小鼠中，利用两种小鼠肝癌细胞系（Hepa1-6、H22）构建皮下成瘤模型和肝脏原位成瘤模型；在裸鼠中，利用两种人肝癌细胞系（Huh7、HepG2）构建皮下成瘤模型。体外实验：探究PSMP对巨噬细胞（人白血病单核细胞系THP-1和小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDMs）极化的直接影响。此外，我们还对来自小鼠的BMDMs进行了转录组测序，从而探究PSMP调控HCC进展的信号通路。

本课题中，通过对HCC患者的样本检测，我们发现PSMP在人肝癌原位组织中显著低表达，并且其表达水平与HCC患者预后呈正相关。体内实验发现，敲除PSMP可明显促进小鼠皮下和肝脏原位肿瘤的形成；敲除PSMP可明显抑制小鼠肝脏中CD8+肿瘤浸润性T淋巴细胞的浸润（TILs）和促进M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化。体外实验发现，PSMP可促进小鼠BMDMs和人THP-1向M1型极化，抑制其向M2型极化。同时，转录组测序发现PSMP可能通过PI3K/Akt信号通路调控巨噬细胞的极化。进一步，我们验证了PSMP通过下调p85和Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt通路，从而介导其对巨噬细胞M2性极化的抑制作用。

PSMP可能通过PI3K/Akt信号通路调控肝脏肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的浸润和极化，从而抑制HCC的进展。本文的研究成果将有望首次阐明新趋化因子PSMP在肝脏肿瘤微环境中的具体作用和分子机制，具有重要的理论意义，也可能为HCC的临床治疗提供新的靶点，具有潜在的应用价值。

SAT-262: The mutated ENTPD6 as neoantigen in hepatocellular carcinoma

来源于体细胞突变产生的，存在于肿瘤组织中，而不存在于正常组织中的肿瘤新生抗原（neoantigen），具有较高的肿瘤特异性及较强的免疫原性。尽管现有的临床试验已经证实了基于新生抗原的免疫治疗在肝细胞癌上取得较好的结果，但目前仍然无法确定在产生免疫应答的治疗中哪些新生抗原为优势新生抗原。在本研究中，我们建立了共表达患者的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和抗原肽的Co-HA单质粒系统。可进一步用于检测肿瘤新生抗原的免疫原性，从而鉴定出肝细胞癌患者中的优势新生抗原。

本研究共纳入了14例肝细胞癌患者用于高通量测序，进一步进行基因变异分析和预测潜在新生抗原。然后，我们构建了Co-HA系统用于鉴定新生抗原所引起的特异性细胞毒作用。最后，我们使用四聚体染色技术筛选出潜在的肝癌优势新生抗原并使用Co-HA系统结合流式细胞术、ELISPOT和ELISA等技术对其进行验证。

首先，我们在14例肝细胞癌患者中鉴定了2875个体细胞突变，C>T/G>A转换是主要的碱基替换形式，特征4、1和16是主要的突变特征，我们发现的高频突变基因有HMCN1、TTN和TP53等。接着，我们预测得到了541个潜在新生抗原。然后，我们使用四聚体染色法对HLA-A*24:02、HLA-A*24:02和HLA-A*02:01呈递的37个预测得到的新生抗原进行了初步地筛选。进一步使用Co-HA系统鉴定出：来自突变的ENTPD6基因，HLA-A*24:02限制性多肽5’-FYAFSCYYDL-3’，在肝细胞癌中具有较强的免疫原性。最终，我们选择共表达HLA-A*24:02和ENTPD6新生抗原的Huh-7细胞作为靶细胞，接种到B-NDG-B2mtm1Fcrntm1(mB2m)小鼠模型上，当肿瘤体积达到150 ± 50 mm3时，每两天使用一次新生抗原特异性T细胞进行瘤内注射。在三次治疗之后，表达新生抗原5’-FYAFSCYYDL-3’的肿瘤体积和重量均显著小于表达其配对的野生抗原的肿瘤。

在肝细胞癌患者中，来自突变的ENTPD6基因，HLA-A*24:02限制性多肽5’-FYAFSCYYDL-3’，是具有高免疫原性的优势新生抗原。

SAT-458: Lower ALT levels are associated with increased all-cause and cardiovascular mortality in patients with NAFLD in the United States population

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平常被认为是评价肝病活动性和肝损伤严重程度的指标，本研究旨在评估NAFLD患者中ALT水平与全因及心血管死亡率之间的关系。

采用1988～1994年国家健康和营养检查调查（NHANES-III）和2019年NHANES-III相关死亡率数据。NAFLD定义为超声诊断的肝脏脂肪变性，无其他肝脏疾病。根据不同的正常值推荐上限（男性30 U/L、女性19 U/L），将男女ALT水平分为<0.5正常值上限（uln）、0.5-1 uln、1-2 uln、≥2 uln四组。采用cox比例风险模型分析全因死亡率和特异性死亡率的风险比（hr）。< />>

多因素logistic回归分析显示NAFLD的优势比与血清ALT水平升高呈正相关。在NAFLD患者中，ALT<0.5 uln时全因死亡率和心血管死亡率最高，alt≥2 uln时癌症相关死亡率最高。在男性和女性身上都发现了同样的结果。单因素分析显示，alt水平正常的重度nafld患者，其全因死亡率和病因特异性死亡率最高，但在调整年龄和多因素后差异无统计学意义。< />>

NAFLD的风险与ALT水平呈正相关，但当ALT＜0.5 ULN时，全因死亡率和心血管死亡率最高。无论NAFLD的严重程度如何，相比于高水平的ALT，正常或较低水平的ALT与较高的死亡率相关。临床医生不仅应注意提示肝损伤的高ALT，还应注意与高死亡风险相关的过低ALT。

FRI-361: Pyroptosis plays a key role in primary biliary cholangitis of humans and mice

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种进行性非化脓性肝内胆汁淤积性疾病，被认为是一种与环境和遗传有关的免疫性疾病。据报道，约40%的PBC患者对一线治疗熊去氧胆酸（UDCA）应答不佳，导致预后不良并缺乏有效的治疗。焦亡是一种新近发现的细胞死亡途径，其特征是由gasdermin介导的程序性坏死，已被证明与多种肝脏疾病有关。然而，焦亡是否参与PBC的发病尚不清楚。在本研究中，我们旨在研究焦亡在PBC患者及模型小鼠中疾病的参与情况，并探索焦亡途径作为PBC潜在治疗靶点的可能性。

研究方法：收集6例无其他肝脏疾病史的PBC患者的肝组织活检，并以没有其他肝脏疾病证据的患者正常的肝脏组织学为对照。选取4～6月龄雌性C57BL/6小鼠20只，平均分为PBC组和对照组。用2-壬壬酸（2OA-BSA）和多胞酸（poly I: C）诱导PBC小鼠共12周。采用PBC患者（n=90）和非肝脏疾病对照组（n=47）的全血样本，对基因表达综合（GEO）数据库GSE119600数据集进行免疫细胞类型相关性分析。应用免疫组织化学（IHC）染色对PBC患者和小鼠肝脏标本中gasdermin D（GSDMD）的表达进行染色，并测定GSDMD及经典凋亡通路在PBC模型小鼠中的表达水平。

免疫细胞类型相关分析显示，PBC患者M1巨噬细胞关键转录因子NOS2、IRF5、PTGS2的表达水平显著高于对照组（P<0.05）。pbc患者肝脏样本中gsdmd的表达水平显著提高，且pbc肝脏标本gsdmd的ihc染色显示出巨噬细胞的分布模式。对于2oa诱导的pbc小鼠模型，焦亡途径相较于对照小鼠上调。qrt-pcr和western blotting结果显示，gsdmd mrna（p<0.05）和蛋白水平（p<0.05）均较正常对照组显著升高。此外，qrt-pcr提示，经典焦亡途径的关键分子（即nlrp3-caspase-1-gsdmd）的表达水平均显著高于对照组（p<0.05）。免疫组化染色也显示，尤其是门静脉周围，pbc小鼠gsdmd和caspase-1的表达较对照组显著升高。< />>

焦亡在PBC患者和2OA-BSA诱导的PBC小鼠中起到了关键作用，其中巨噬细胞可能是最重要的执行者。抑制焦亡途径或是未来治疗PBC的潜在目标。