iMeta｜南方医科大学刘志华揭示高盐饮食诱导突触丧失和记忆损伤

● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.97

● 2023年3月21日，南方医科大学刘志华和广州医科大学刘亭团队等在 iMeta 在线发表了题为 “A high-salt diet induces synaptic loss and memory impairment via gut microbiota and butyrate in mice” 的文章。

● 本研究评估了用HSD和正常盐饮食（NSD）喂养的小鼠的记忆功能、突触蛋白表达、肠道微生物群组成和SCFAs的产生。

● 第一作者：雷超、刘聪、彭玉玲

● 通讯作者：

刘志华 (liuzhihualzh@hotmail.com)、

刘亭(liuting1985@gzhmu.edu.cn)

● 合作作者：占玉、张小明

● 主要单位：南方医科大学附属东莞医院（东莞市人民医院）肛肠科；广州医科大学第五附属医院；华中科技大学联盟深圳医院

●  HSD影响了产生丁酸细菌(Butyricimonasvirosa)的相对丰度和丁酸盐的产生，从而降低了突触蛋白(SYP和SYN1)的表达，损害了短期和长期记忆，而补充丁酸盐抑制了突触基因的表达和记忆障碍。

●  从喂食HSD (rHSD)的小鼠中接受粪便微生物群移植的小鼠也表现出丁酸盐产生减少、突触蛋白(SYP和SYN1)表达减少和记忆缺陷。

●  这项研究表明，肠道微生物群和丁酸盐的产生参与了HSD对突触和记忆的影响，而PI3K-Akt通路的调控异常可能介导了这些影响。

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过量的盐摄入会损害小鼠记忆功能，但其对肠道菌群的意义仍在很大程度上未被探索。在本研究中，我们探讨了肠道菌群、高盐饮食（HSD）、突触和记忆功能之间的关系。采用Y-迷宫测试和新物体识别实验分别评估短期记忆和长期记忆。采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和western blot方法检测突触蛋白的表达水平。选择微生物组16S核糖体DNA（rDNA）测序评价粪便微生物群的变化，气相色谱-质谱（GC-MS）检测短链脂肪酸，转录组测序检测脑基因变化。结果表明，HSD影响了丁酸盐产生菌（病毒丁酸单胞菌）的相对丰度以及丁酸盐的产生，从而降低了突触蛋白（SYN1）的表达，损害了短期和长期记忆。在粪菌移植（FMT）后也观察到了类似的结果。此外，HSD对记忆损伤的影响与磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路有关。本研究发现，HSD可影响肠道微生物群和丁酸盐的产生，并通过PI3K-Akt通路，通过突触蛋白SYN1影响突触和记忆。

由于预期寿命的提高和不健康的饮食习惯，认知健康状况的降低越来越多，其中HSD与认知障碍相关。记忆功能是第一个受损的核心认知区域。虽然喂食HSD的小鼠表现出突触蛋白失调的记忆缺陷，但其分子机制尚不清楚。记忆障碍通常是由各种神经系统疾病引起的。微生物群-肠道-脑轴在调节认知功能方面至关重要。此外，有越来越多的证据支持微生物群在认知障碍中的作用和特定微生物群在记忆功能中的作用。例如，有报道称螺旋乳杆菌可以防止西方饮食引起的记忆障碍。据报道，肠道微生物群还通过各种途径，包括短链脂肪酸（SCFA）代谢，影响神经发育、突触可塑性、髓鞘形成和复杂的宿主行为。饮食模式是影响人类健康的肠道微生物群组成的关键调节器，其生物过程和HSD可以改变宿主和肠道微生物群之间的互惠共生关系。有报道称，丁酸钠（NaB）可通过海马磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白的途径改善辐射诱导的认知损伤。另一项研究表明，NaB可以改善小鼠的突触可塑性。腹腔注射NaB可立即引起弱记忆大鼠的记忆再激活和记忆增强。然而，目前尚不清楚HSD诱导的微生物群失调和认知障碍是否存在相关关系，或者微生物群失调是否介导了HSD诱导的认知障碍。

PI3K/Akt通路是神经元细胞生长、存活和分化的重要中介，涉及认知障碍和突触的形成和维持。PI3K-Akt通路被发现是大脑发育时轴突生长锥形成过程中微管运输的基础，这被认为是成人大脑的关键，因为它在维持突触可塑性。该通路可以增加GABA受体的磷酸化和齿状回颗粒细胞的存活，这是保证促进突触强度和可塑性]的两个过程。肠道微生物群和短链脂肪酸的生态失调被认为是该通路的调节剂。

在此，我们假设突触功能和记忆损伤与HSD和一种特定的肠道微生物群有关。在我们的研究中，我们评估了用HSD和正常盐饮食（NSD）喂养的小鼠的记忆功能、突触蛋白表达、肠道微生物群组成和SCFAs的产生。此外，我们还研究了喂食HSD的小鼠和喂食NSD的小鼠的FMT是否有助于识别影响大脑转录组的因素，并探索了肠道微生物群、饮食（HSD或NSD）、突触和记忆之间的关系。

为了探讨HSD对认知功能的影响，我们分别进行了两项行为测试来评估短期和长期记忆功能。NSD和HSD喂养的小鼠表现出相似的食物摄入量、体重（支持信息：图1A、B）和小肠和结肠的长度（支持信息：图1C，D）。然而，HSD喂养的小鼠有更高的水和盐的摄入量（支持信息：图1E，F）。HSD组持续自发交替行为减少（图1A），提示短期记忆障碍。总条目数略高于NSD组（支持信息：图2A），这可能是由HSD相关的焦虑引起的。

同时，HSD组在长期记忆方面表现出缺陷，表明在新物体识别任务中探索时间的比例减少（图1B）。然而，在识别阶段，总探索时间没有差异（支持信息：图2B），这表明HSD对运动没有显著影响。在Morris水迷宫的探针试验中，HSD组的平台交叉次数低于对照组（支持信息：图3A，B），与之前报道的结果一致。此外，与NSD组相比，HSD组的SYP和SYN1的mRNA水平下降（图1C，D）。

通过16S rDNA测序确定粪便微生物组（支持信息：图4A）。Shannon指数与Chao1指数无显著性差异（支持信息：图4B，C）。此外，我们观察到HSD诱导的肠道微生物群的显著差异聚类，这得到了Bray–Curtis差异（图1E）和Jaccard距离（支持信息：图4D）的支持，非度量多维尺度（NMDS）也观察到类似的发现（支持信息：图4E）。

为了研究肠道微生物区系的变化，我们使用OTUs分析了两组间不同细菌门的丰度（图1F）。与喂食NSD的小鼠相比，我们发现喂食HSD的小鼠的拟杆菌门明显减少（支持信息：图4F和5A）。值得注意的是，拟杆菌门数量的增加被认为是一种正常和健康的肠道微生物群状态，而拟杆菌门数量丰度的减少与神经系统疾病有关，如抑郁症、精神分裂症和自闭症。此外，类水平上不同细菌丰度分析表明，HSD喂养的小鼠的杆菌也较低（支持信息：图4G和5B）。我们发现，HSD喂养的小鼠显示出与NSD喂养的小鼠不同的细菌谱，体现在一些类群上，如葡萄球菌和粪杆菌属（支持信息：图5C）。这些结果通过在属水平上的随机森林分类分析进一步验证（支持信息：图5D），结果表明，细菌类群对两类小鼠样本的区分主要包括杜博氏菌、粪杆菌、乳杆菌、副生菌和丁酸单胞菌。

接下来，我们在物种水平上探索了特异性分化，并鉴定了5种显著改变的细菌。结果表明，在HSD喂养的小鼠中，B. 病毒和约氏乳杆菌的丰度显著减少，啮齿动物、木糖葡萄球菌和人副生菌的丰度显著增加（支持信息：图5E-I），以及 B. 病毒可以将纤维代谢为丁酸。近年来，丁酸在肠道稳态方面受到了关注。

SCFAs在微生物-肠-脑轴中起着重要作用。我们还发现，在HSD喂养的小鼠中，产丁酸盐的病毒弧菌显著降低。因此，我们在两组量化官腔短链脂肪酸，并发现，HSD喂养的小鼠丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸水平较低，而HSD或NSD喂养的小鼠乙酸和己酸水平相似（支持信息：图6）。综上所述，HSD诱导了肠道微生物群组成和SCFAs的产生的显著变化，而这种变化对记忆功能有不利影响。

在这里，我们研究了由HSD诱导的肠道微生物群的改变是否会影响认知能力。从NSD或HSD喂养的小鼠中收集粪便样本，然后移植到NSD喂养的小鼠中（图2A）。当分析粪便微生物群，我们观察到rNSD小鼠（接受NSD喂养小鼠的粪便样本）和rHSD小鼠（移植了HSD喂养小鼠的粪便样本）之间肠道微生物群的显著差异，正如主坐标分析（PCoA）所示（图2B)。进一步的分析证实了两个受体组的微生物群门之间的差异（图2C，D），包括受HSD影响的门，如拟杆菌门。与rNSD小鼠相比，rHSD小鼠表现出明显的记忆损伤，而在Y迷宫试验中没有观察到明显的结果（图2E、F和支持信息：图7G、H）。

此外，我们检测了两组受体小鼠中SYP和SYN1的表达水平，发现与rNSD小鼠相比，rHSD小鼠中SYN1的mRNA和蛋白表达均下降（图2G，H），而SYP中没有明显变化。我们还检测到了SCFAs和rHSD小鼠的丁酸显著下降（图2I），而两个受体组的其他6个SCFAs之间没有差异（支持信息：图7A-F）。我们的研究结果表明，HSD诱导的微生物群失调可促进认知功能障碍和突触丧失。

我们对来自rNSD和rHSD小鼠的大脑样本进行了全长转录组测序。两组在总基因表达水平上表现出相似的破坏和变化（支持信息：图8A，B）。然而，通过主成分分析观察到基因表达的显著差异聚类（支持信息：图8C），两组均表现出不同的转录因子活性（支持信息：图8D），这表明HSD相关的微生物群参与了大脑基因表达。此外，rHSD和rNSD小鼠共表达了489个显著和差异的基因（DEGs），其中包括197个上调基因和292个下调基因。我们使用热图来可视化这些deg（支持信息：图9A、B和表1）。对rHSD小鼠与rNSD小鼠相比的差异调控基因进行了基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析。对DEGs的GO富集分析显示，rHSD小鼠的突触功能和组成均弱于rNSD小鼠。例如，在生物过程方面，参与化学突触传递的突触前过程显著丰富。对于细胞成分，我们注意到突触和突触部分显著富集（支持信息：图9C），揭示了调节突触功能和组成的基因表达的广泛下降，这对记忆和学习是有效和必不可少的。对rHSD小鼠与rNSD小鼠中差异调控的基因进一步进行KEGG通路富集分析，我们在两组中观察到几个显著不同的KEGG通路。PI3K/Akt信号通路显著失调（支持信息：图9D）。为了进一步验证被HSD激活的PI3K的作用，我们进行了免疫印迹检测，结果显示，经HSD预处理后，PI3K/Akt信号通路增强（支持信息：图9E）。

我们假设，丁酸盐产量的减少可能至少部分地解释了认知障碍。因此，在饮用水中给予20 mg/kg丁酸钠16周，研究HSD与认知之间可能的因果中介丁酸。结果显示，丁酸盐的加入部分抑制了HSD饲粮引起的记忆损伤（图3A、B和支持信息：图10A、B）。我们进一步探讨了丁酸盐对突触的影响，发现与简单的HSD喂养小鼠相比，HSD喂养小鼠的SYN1 mRNA表达发生了显著变化（图3C，D）。

此外，添加丁酸盐对微生物群落组成没有显著影响（图3E，F）。向HSD喂养的小鼠添加丁酸盐对结肠中的丁酸盐水平（图3G）和其他SCFAs（支持信息：图10C-H）没有显著影响。我们的研究结果表明，丁酸盐不会引起细菌组成的改变或丁酸盐水平的增加，但可以独立地限制HSD对记忆功能的损害，这可能是通过调节SYN1而发生的。

据报道，饮食和微生物群组成对维持认知功能至关重要。本研究表明，饲粮中高浓度的氯化钠可以通过降低丁酸盐产生菌的丰度和丁酸盐的水平，来调节肠道菌群的组成和代谢物。此外，肠道微生物群可能是HSD导致的记忆功能损伤的关键中介，因为喂食HSD的小鼠肠道微生物群的变化与记忆功能受损有关。

饮食是微生物群组成和功能最有效的调节剂之一。我们的研究调查了HSD和肠道微生物群之间的关系。值得注意的是，与之前关于HSD 的研究不同，我们没有在小鼠的饮用水中添加盐，这有助于更好地模拟人类不健康的饮食习惯。结果显示，12周的HSD显著影响了肠道微生物群，并在门水平和类水平上减少了拟杆菌门，这与炎症状态相关。此外，有益病毒杆菌和丁酸含量的降低与健康的脑生理有关。Hu等人的发现，12周的HSD显著降低了粪便样本中的乙酸、丙酸和丁酸水平，Miranda等报道了4周的HSD显著降低了丁酸盐浓度。尽管在这些研究中存在不同类型的干预和饲料持续时间，但它们对肠道微生物群组成和SCFAs生产显示了类似的后果。因此，在病毒弧菌中观察到的减少可能至少部分地是丁酸水平降低的间接原因。

新的证据表明，HSD可能损害认知功能，一项研究表明，盐摄入量与认知障碍和表现之间存在关联。大多数啮齿动物模型的研究发现，高盐摄入（通常为4%-8%）会存在认知障碍。我们的研究结果表明，在12周的饮食中添加8%的盐就足以损害认知功能，特别是长期记忆、空间学习和记忆。然而，只有少数研究直接研究了其潜在的机制，另一份报告显示，认知功能障碍可能是由内皮型一氧化氮的缺陷介导的。与之前的研究一致，我们的结果表明，HSD影响与记忆相关的突触，从而导致认知障碍。我们发现HSD显著降低了SYP和SYN1的表达。这些分子被认为与突触可塑性有关，他们与神经递质的释放有关，并促进快速和有效的神经传递。在其他研究中观察到记忆和SYP相关蛋白之间的关系，这表明膳食盐可能影响突触相关的记忆功能。

Syeda等人指出，生物活性食物可以通过影响阿尔茨海默病（AD）中的肠道微生物群来减轻突触的改变，而布芬顿等人发现，微生物群的重组逆转了饮食诱导的小鼠社会缺陷。这些发现表明，HSD对肠道微生物群组成的改变是通过肠-脑轴对突触缺陷的影响实现的。在这里，我们观察到12周的FMT损害了短期和长期记忆。值得注意的是，接受喂食HSD小鼠粪便的NSD的小鼠也显示出SYP和SYN1表达的减少，以及rHSD小鼠大脑不同于rNSD大脑，rHSD小鼠突触显著改变。此外，基因集合富集分析揭示了rHSD小鼠大脑中突触结构和功能下调的通路，如正向调控突触传递、突触可塑性、长期增强的正向调控，以及突触的结构，如突触前膜。因此，肠道微生物群有助于调节突触的结构和功能，这可以部分解释HSD如何影响记忆功能。

为了更确定性地验证这一解释，我们评估了FMT对肠道微生物群组成和SCFAs产生的影响。与预期的一样，受体小鼠的肠道微生物群组成以及SCFAs的产生，似乎向喂食HSD的小鼠的模式转移。最近的研究表明，肠道微生物通过影响突触稳态诱导的神经病变失衡。一项研究表明，来自老年捐赠者的FMT会导致年轻接受者的学习能力受损。此外，观察到与SCFAs产生相关的细菌减少。另一项研究表明，肠道微生物群影响了健康小鼠的大脑。受体小鼠的记忆和短期物体识别记忆均有所降低。根据这一证据，我们发现喂食HSD的小鼠的肠道微生物群有认知功能受损以及突触损伤，包括短期物体识别记忆和工作记忆，这表明肠-脑轴受到干扰。

为了进一步探索突触丢失的机制，我们测试了大脑转录组。KEGG通路分析发现了rHSD小鼠大脑中PI3K/Akt信号通路的改变，提示肠道微生物群可以介导其变化。PI3K/Akt通路对于启动免疫应答至关重要。然而，该通路的失调可导致有害影响，这是肿瘤发生的主要因素。鉴于已知的炎症反应的作用发生在大脑，PI3K/Akt信号的失调也可能导致神经炎症的发生和持续，从而表明PI3K/Akt信号可以驱动促炎细胞因子的产生，导致突触丧失和认知障碍。

肠道微生物群调节肠道循环中几个单一功能或多功能信号分子的浓度。我们观察到在喂食HSD的小鼠中SCFAs代谢的改变，特别是丁酸盐。同时，HSD小鼠和NSD小鼠的FMT也降低了丁酸含量。然而，补充丁酸盐改善了记忆功能和突触相关mRNA的表达。丁酸盐主要由结肠内纤维的细菌发酵产生，这也可以改变大脑中的基因表达。

此外，Jiang等人发现，补充丁酸盐可以提高AD小鼠的突触相关蛋白水平和行为表现。与之前的研究一致，我们的研究结果表明，丁酸盐产生的减少介导了HSD诱导的突触丧失和记忆损伤。然而，其确切的机制仍有待研究。这可以被认为是我们研究的一个局限性，我们旨在在我们未来的研究中澄清它。

总之，目前的研究表明，通过微生物代谢物与HSD有一种新的联系，表明HSD在改变微生物组和丁酸盐生产中的作用，从而导致突触损失和记忆损伤。此外，我们的研究结果表明，PI3K-Akt通路的失调可能是一个重要的分子信号通路。然而，还需要更多的工作来研究大脑中HSD的模式，以及这些结果是否与PI3K-Akt通路的失调有关。尽管确切的作用机制仍不确定，但目前的研究为过量的饮食盐对记忆的机制提供了新的见解。此外，丁酸盐与记忆改善有关，并可能被考虑用于治疗记忆障碍。

HSD影响丁酸产生菌（B.病毒）的相对丰度和丁酸产量，从而通过PI3K-Akt通路降低突触蛋白（SYN1）的表达，损害短期和长期记忆。

雄性C57BL/6特异性无病原体（SPF）小鼠（6周龄，18-20克）从广东省医学实验动物中心购入。小鼠被安置（每个笼子里4到5只老鼠）在一个SPF环境与合适的温度（22°C±2°C），湿度（45%-60%），保持每24小时里12小时的光，以及适量的食物和水。为了验证HSD与认知之间可能的因果中介因素，在饮用水中加入20 mg/kg丁酸钠，并给予16周。饮用水每两天更新一次。然后将小鼠分成四组，喂食16周：正常饲料（NSD，0.2%盐，研究饮食公司，1001）；HSD（8%盐，研究饮食公司，定制饲料）；NSD与饮用水中20mg/kg的丁酸钠（S817488，麦克林）（NSD + NaB）；HSD与饮用水中20mg/kg的丁酸钠（S817488，麦克林）（HSD + NaB）。所有实验均经过了广州医科大学动物护理和使用动物伦理委员会的检查和批准。在上午完成上述处理后3天采集小鼠粪便样本。

在FMT实验中，供体小鼠分别喂食NSD或HSD（每组=8）16周，受体小鼠（每组=10）用NSD喂养16周。一种抗生素混合物通过口服灌胃1周，以耗尽微生物群。肠道微生物群的消耗是如前所述的。小鼠给予万古霉素（50 mg/kg）、新霉素（100 mg/kg）、甲硝唑（100 mg/kg）和氨苄西林（100 mg/kg）的鸡尾酒疗法，每日1次，持续7天。每天将抗生素粉溶于超纯水中，口服灌胃量为10 μL/g。最后灌胃抗生素24 h后，口服灌胃FMT（10μL/g），持续12周（每周5次，周一至周五）。FMT按照之前研究中描述的方法进行。总的来说，我们在早上抓住供体小鼠，轻滑鼠的腹部，用钳促进排便，从结肠收集粪便，放在1.5毫升离心管，迅速添加0.5毫升盐水到离心管，涡旋混匀。然后以2000g的速度离心5 min，取出上清液后加入生理盐水，过滤后收集过滤液。该液体通过灌胃的方式注射给受体小鼠。完成后3天，在接下来的早上饲粮处理和采集FMT样品进行分析。

在饮食预处理或FMT结束后3天进行行为测试。y型迷宫测试评价空间工作记忆以及短期记忆。测试是在由三个手臂（40×10×15厘米）组成的Y迷宫中进行的，彼此成120角，每只手臂上有不同的几何形状。首先将小鼠放置在其中一只手臂上的固定位置，并允许其自由探索手臂10 min。然后，这些老鼠被送回了它们的笼子里。1h后，将小鼠置于同一位置，并在三组小鼠中自由运动5 min。当它们所有的四肢都在一只手臂内时，这被认为是老鼠成功地进入相应的手臂。一种交替定义为连续进入所有三条手臂。记录手臂进入和改变（自发改变/（手臂进入次数−2）×100%）。很高的比例被认为是良好的工作记忆，因为这表明老鼠回忆了它进入的手臂。

用于评估长期记忆的新物体识别任务是根据之前发表的研究进行的，新物体识别任务的执行，小鼠首先在一个没有任何物体的开放区域进行5 min的习惯测试，然后是24小时后由两个试验开始的测试阶段。在第一次试验中，两个物体被平行放置在野外，小鼠被允许探索它们5 min（样本阶段）。在这一阶段结束时，小鼠返回各自的笼子，延迟15 min（±15 s）的笼子。在测试过程中，其中一个物体被替换为一个新的物体，并且这些小鼠再次被放置在野外进行另一个5 min的试验。对于样本和测试阶段，探索被定义为一个活跃的事件，其中大鼠从~1厘米的距离用鼻子抓、嗅或拍打物体。坐在物体上或物体旁边不被视为主动探索，在样本和测试阶段，我们使用手动计时器来对老鼠探索（嗅探或触摸）物体的时间进行评分。实验者的评分探索时间对动物的干预不知情。所使用的物体是在每个训练期前用70%的乙醇清洗过的类似大小的小玩具。探索新对象的时间百分比计算公式如下：探索新对象的时间/（探索新对象的时间+探索熟悉对象的时间）×100% 。Morris水迷宫按照的方法进行。第6天进行探针试验；移除隐藏的平台，将小鼠放置在目标象限对面的象限，并让其游泳90秒。对平台跨越的次数进行了评分。

饲粮或FMT预处理后3天，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，分离大脑，在−20°C下快速冷冻5 min。然后分离海马，在−80°C下保存。解剖组织中总RNA分离使用TRIZOL（R0016，生物技术），互补DNA（cDNA）生成使用 PrimeScript™ RT reagent (9109, TAKARA)，RT-qPCRTB Green Premix Ex Taq™ II (RR820A, TAKARA)，使用来自IGE生物技术公司的引物对指定的靶基因进行定量，并相对于β-actin进行定量为ΔΔCT。采用2-ΔΔCT法进行反应，所有反应均设置为两个多孔。采用PCR方法检测SYP和Syn1。引物见支持信息：表2。

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶、PVDF膜（微孔）和电泳仪（Bio-Rad）在100 V 下进行120 min分离蛋白质。膜与一抗在4°C下孵育过夜，与二抗在tris缓冲液孵育1小时，tris缓冲液中需加0.1%吐温20，在4°C放置4小时。膜采用增强化学发光法（ECL试剂盒；Pierce）法显影。

SCFAs量化

粪便SCFAs浓度由WEKEMO技术有限公司测定。简单地说，将粪便（~100 mg）解冻悬浮，加入50 μL 15%磷酸和100 μL 125 μg/mL内标（异己酸）溶液，醚400 μL匀浆（多管混合器BE-2600）1 min，然后12000 rpm离心10 min。上清液过滤后进行气相色谱-质谱分析（Thermo Trace 1300）。气相色谱-质谱分析的注入样品体积为1µL。

使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒（Qiagen）从粪便样本中提取细菌DNA。构建测序文库，然后在生物标记技术有限公司的Illumina MiSeq平台上进行对端测序（2×250 bp）。使用QIIME2软件分析肠道微生物区系α多样性。α多样性指标包括Chao1指数、Ace指数、香农指数和辛普森指数。β-多样性通过呈现基于Bray-Curtis差异、Jaccard距离和NMDS的PCoA进行分析。采用Metastats软件比较两组间不同水平上的细菌相对丰度，p值通过非参数检验得到。通过校正p值来获得q值，根据p值（或q值）筛选负责两组之间样本组成差异的物种，默认p≥为0.05。用LefSe比较两类群在门、纲、属水平上的相对丰度。使用线性判别分析（LDA）来估计效应的大小，将显著性差异的对数LDA得分设置为2.0。这项分析的主要目的是发现不同群体间丰度有显著差异的物种。

这些cDNA文库在Illumina HiSeqX-tenten平台上进行测序。简单地说，使用cDNA-PCR测序试剂盒（SQK-LSK110 + EXP-PCB096），使用1 μg总RNA制备cDNA文库。逆转录酶模板转换活性导致全长cDNA的富集，并直接在第一链cDNA的末端添加定义的PCR接头。用LongAmp Tag（NEB）扩增14个cDNA。然后使用T4 DNA连接酶（NEB）对PCR产物进行ONT接头连接。使用AgcourtXP珠基于ONT协议进行DNA纯化。最终的cDNA文库被添加到FLO-MIN109流式细胞中，并在生物标志物技术公司的PromethION平台上运行。使用edgeR软件包（3.8.6）对数据进行差异表达分析，以使用基于负二项分布的模型来识别数字基因表达数据中的差异。使用本贾米尼和霍赫伯格的方法调整P值以控制错误发现率。最后，以edgeR鉴定的p<0.05和fold变化≥1.5的基因命名为差异表达。

采用KOBAS软件（http://www.genome.jp/kegg/）检测KEGG通路中差异表达基因的统计学富集情况。

使用了SPSS v25.0软件（IBM公司）。正态分布变量采用配对t检验，非正态分布变量采用非配对t检验（Mann-WhitneyU检验）进行分析。两组间比较的p<0.05被认为具有显著性。

引文格式：

Chao Lei, Cong Liu, Yuling Peng, Yu Zhan, Xiaoming Zhang, Ting Liu, Zhihua Liu. 2023. "A high-salt diet induces synaptic loss and memory impairment via gut microbiota and butyrate in mice." iMeta e97. https://doi.org/10.1002/imt2.97

●  广州医科大学学术型硕士。

●  研究生期间研究方向为饮食模式调节肠道菌群影响神经系统疾病的机制。

●  广州医科大学学术型硕士。

●  研究生期间研究方向为饮食模式调节肠道菌群影响神经系统疾病的机制。

●  广州医科大学攻读学术型硕士。

●  研究生期间研究内容包括肠道菌群、脑肠轴，神经再生等。

●  南方医科大学附属东莞医院（东莞市人民医院）肛肠科学科主任，主任医师、教授、研究员、博士研究生导师、博士后导师。

●  广东省科技创新青年拔尖人才、广东省杰出青年医学人才，东莞市医学领军人才。中国老年保健协会盆底医学专业委员会常务委员、中国民族卫生协会培训部特邀专家（肛肠科）、中国民族卫生协会卫生健康卫生健康技术推广专家委员会常务委员、中国医师协会外科医师分会加速康复外科专家委员会委员、中华医学会肠外肠内营养学分会肠道微生态与临床营养协作组委员、中国医药教育协会微生态与健康教育专业委员会委员、中国胃肠外科卓异青年联盟委员、广东省自然医学研究会肠道健康专业委员会主任委员、广东省精准医学应用学会结直肠癌分会委员、东莞市医学会结直肠肛门专业委员会主任委员。承担国家自然科学基金项目，教育部产学研项目，广东省自然科学基金重大项目、广东省教育厅重大项目、团队项目等重大基金多项，发表论文80余篇，发明专利6项。