2023年合成生物学竞赛·创新赛第十四期《常规赛科普专题》文章来自武汉大学CRISPReporter团队，题为“基因魔剪——CRISPR/Cas”。
基因魔剪——CRISPR/Cas
随着研究技术的发展，我们对基因的了解已经从宏观的表现型层面逐步深入微观的生物大分子层面。现在，我们已经能够在分子层面对基因进行编辑，通过较为简单的步骤对植物、动物或者微生物的基因组进行敲除或插入基因的操作。这些成果的实现，离不开一个非常有用的工具——基因剪刀CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas（CRISPR associated proteins）系统。下面，让我们来认识一下这把“神奇的剪刀”。
PART 1
何为CRISPR？
CRISPR/Cas9系统是一种从细菌等微生物中发现的，可用于实现细胞内基因编辑的工具。CRISPR-Cas9系统由于其易于设计、简单高效，已成为广泛用于生物体基因组操作的强大工具，它的作用机制充分体现了生命的精妙。
CRISPR/Cas9 系统主要通过Cas9和guide RNA组装形成的CRISPR/Cas9效应复合物实现位点特异性的DNA识别和切割，从而实现基因编辑（Jiang F & Doudna JA 2017; Gupta D et al.2019）。Cas9是一种大型、多结构域的DNA内切酶。它通过两个不同的结构域，HNH核酸酶结构域和RuvC核酸酶结构域，对原间隔序列临近基序PAM（protospacer adjacent motif）上游3 bp处的双链DNA进行切割。其中，HNH结构域切割与guide RNA互补的DNA单链，RuvC结构域负责切割另一条DNA单链。Guide RNA引导Cas9到达特定位点，从而特异性切割DNA。
在天然微生物中，guide RNA是由CRISPR RNA（crRNA）和反义激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）碱基互补配对形成的双RNA杂交结构。crRNA的5’端包含20-nt spacer序列，以碱基互补配对特异性识别DNA。当DNA片段包含与spacer序列互补片段以及相邻PAM，该位点就能被CRISPR-Cas9效应复合物特异性识别并切割。在实际应用中，通常用合成的sgRNA（single-guide RNA）来模拟自然的tracrRNA-crRNA结构。sgRNA携带有与目标DNA序列互补的5 '端20-nt guide序列，从而实现对基因组中靶向位点的特异性识别。
了解了CRISPR-Cas9效应复合物后，我们来看看CRISPR-Cas系统发挥作用的具体过程（见图1）。首先，细胞表达出Cas9和sgRNA，进而结合形成CRISPR-Cas9效应复合物。然后， sgRNA通过20-nt guide序列引导内切酶到基因组中的切割位点，并进一步引导Cas9在目标基因组DNA中切割，引入双链断裂（double-strand break，DSB）。DSB通过宿主自身的DNA修复机制进行修复。在缺乏修复模板的情况下，容易出错的非同源末端连接修复 （non-homologous end-joining, NHEJ）被激活。此时双链断裂处可能发生片段的随机插入，缺失和替换，经常导致基因功能的破坏。在供体模板存在情况下，可以启动同源定向修复（homology directed repair , HDR）。通过同源重组，能够在靶点产生所需的突变。这为进行精确的基因修饰如基因敲入、缺失、校正或突变提供了基础。
图1：CRISPR-Cas9介导的基因编辑机制
Jiang F & Doudna JA 2017
PART 2
“魔剪”的前世今生
实际上，从人们最早发现CRISPR相关序列，到CRISPR/Cas技术应用到基因编辑，只过了二十多年的时间。
1987年，Nakata研究组在他们的论文中首次提到CRISPR序列。当然，他们当时并不知道这是CRISPR序列，只是偶然地在大肠杆菌基因中发现了一种不同寻常的结构：大肠杆菌Iap基因的3’端存在含有29个碱基的高度同源序列重复性出现，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开（Ishino Y et al. 1987; Ishino Y et al. 2018）。他们对这种结构进行进一步的研究，发现在痢疾志贺氏菌中和鼠伤寒沙门氏菌也检测到这种特殊的序列。1993年，Mojica等人在对古菌的基因进行研究时，也发现了类似的结构（Mojica FJ et al. 1993）。随后，随着生命科学进入基因组时代，研究人员在越来越多的细菌和古细菌基因组中检测到类似结构。
图2：大肠杆菌Iap基因中发现的特殊结构
Y Ishino et al. 1987
2002年，Jansen等人将这种结构命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)，提出了CRISPR一词（Jansen R et al. 2002）。比较基因组学研究阐明了CRISPR的共同特征，即
（i）均位于基因间区域；
（ii）均包含多个短的直接重复序列，序列变异很小；
（iii）均为重复序列与非保守序列（也被称为间隔区）穿插；
（iv）几百个碱基对的共同前导序列均位于重复簇的一侧。
图3：CRISPR结构特征
Yoshizumi Ishino et al. 2018
在研究CRIPSR的过程中，科学家们发现了在CRISPR区域相邻成簇的四个保守基因。这些基因被命名为CRISPR相关序列（CRISPR-associated genes，Cas）。由于它们与CRISPR相关，有人认为Cas蛋白参与了CRISPR位点的发生。
图4：CRISPR序列与相邻的Cas基因
Ruud. Jansen et al. 2002
CRISPR高度的保守性暗示了其可能具有重要的生物学功能。但在当时由于数据较少，其具体生物学意义依然掩于神秘的面纱。直到2005年，“面纱”后的真面目才终于显现——CRISPR与原核生物的免疫系统相关。Francisco J.M. Mojica和C. Pourcel的团队各自发现CRISPR间隔区来自于预先存在的序列（Mojica FJ et al. 2005; Pourcel C et al. 2005）。这些序列可能来自染色体或可移动遗传元件，如噬菌体和结合质粒。值得注意的是，这些染色体外元件不能感染特定的间隔载体菌株，这意味着CRISPR和对目标DNA的免疫之间的关系。同年，Alexander Bolotin等提出了该结论，并且发现嗜热链球菌菌株的噬菌体敏感性似乎与该菌株所携带的CRISPR位点的间隔区数量相关（Bolotin A et al. 2005）。Cas基因表达出的蛋白在CRISPR参与的免疫过程中发挥作用。
最终，在2007年，CRISPR-Cas系统作为原核获得性免疫系统的功能被实验证明（Barrangou R et al. 2007）。Rodolphe Barrangou及其团队将噬菌体序列插入嗜热链球菌CRISPR的间隔区，使该菌株对相应的噬菌体具有抗性。另一方面，当从噬菌体基因组中删除相应的protospacer序列时，这种细菌对噬菌体感染的抗性就消失了。这有力地证明了CRISPR-Cas系统在原核生物中发挥免疫功能。
因为这个独特的功能，CRISPR-Cas系统也成为了开发新一代基因组编辑技术的一个有吸引力的选择。
2012年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna的体外实验揭示了一个使用双RNA进行位点特异性DNA切割的内切酶家族，并突出强调了利用该系统进行RNA可编程基因组编辑的巨大潜力（Wiedenheft B et al. 2012; Jinek M et al. 2012）。
她们纯化出来自病原菌化脓性链球菌的Cas9蛋白，并测试了其切割质粒DNA或与成熟的crRNA的原间隔序列互补的能力。首先，她们确定了一种双RNA结构（tracrRNA: crRNA）引导的DNA识别切割机制，该机制指导Cas9内切酶在目标双链DNA的特异性位点引入断裂。然后，她们将基于原先分离的crRNA和tracrRNA嵌合成线性结构，组成一个单嵌合体RNA，发现也具有相似的功能。2020年，她们因这项发现获得了当年的诺贝尔化学奖。
随后，一场将CRISPR-Cas系统应用到动物基因编辑的竞赛展开了。2013年1月，五篇由不同研究团队撰写的研究文章几乎同时出现，他们都表示他们已经实现了这一目标。
张锋团队证明化脓链球菌CRISPR系统可以在哺乳动物细胞中异种重组，成功实现了高效的基因组编辑（Cong L et al. 2013）。
George Church团队设计了自定义guide RNA (gRNA)指导Cas9，建立了一个rRNA引导的编辑工具，服务于更高通量的人类基因组工程（Mali P et al. 2013）。
Lei S. Qi实验室的研究表明，dCas9与具有不同调控功能的效应域的融合可以在人类和酵母细胞中实现稳定和有效的转录抑制或激活，其传递位点仅由共表达的small guide RNA (sgRNA)决定（Gilbert LA et al. 2013）。RNA-seq分析表明，CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）介导的转录抑制是高度特异性的。研究结果表明，CRISPR系统可以作为一个模块化和灵活的DNA结合平台，用于将蛋白质募集到目标DNA序列，并揭示了CRISPRi作为精确调节真核细胞中基因表达的通用工具的潜力。
自此，基因编辑的新篇章正式拉开帷幕！
PART 3
CRISPR剪出发展蓝图
CRISPR-Cas9 技术具有许多优点。第一，载体构建简单，只需要构建一个几十个碱基的CRISPR sgRNA即可与DNA序列进行匹配。第二，可同时对基因组进行多位点编辑，单个sgRNA即可靶向基因组中的多态位点，不同的sgRNA也可以特异对应基因组上的不同位点，从而满足多种编辑需求。第三，成本低，耗时短，以往的ZFN、TALEN等定点编辑技术常要构建复杂的蛋白序列，相比之下，只用构建RNA的CRISPR-Cas9技术用时更短，成本更低。
尽管存在着不确定的伦理问题，但CRISPR-Cas9技术仍然展现出广阔的应用前景。随着生物信息学和人类基因组学的进一步发展，科学家们可以探索和解决一些关键问题并创造出新的研究领域。
例如，研究人员可以利用该技术，对不同的生物进行基因编辑，以此实现对生物更深入的研究，以及改良育种。在农业方面，CRISPR技术已经成功在番茄、小麦、水稻等主要粮食作物中实现了基因编辑（刘建菊等 2023），在农作物产量提高、育种时间缩短、抗性及品质等农业核心问题上实现重大突破。
目前已有研究成功通过CRISPR-Cas9技术对视觉基因进行编辑，治愈了莱伯氏先天性黑朦症10型(LCA10)，为基因编辑疗法奠定了里程碑（Ledford H， 2020）。它将可以通过精密、定点方式，针对单个基因突变而不影响其他基因情况，从而使基因治疗迈上一个新高度（林锦莹等 2021）。
在医疗领域，CRISPR-Cas9 技术有广泛的应用。当下最为主要的一个应用就是用于构建用于癌症免疫疗法的CAR-T细胞。
CAR-T治疗（嵌合抗原受体T细胞治疗）即将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，靶向用于治疗癌症。传统上，研究人员依靠病毒载体——没有致病成分的病毒壳，将用于基因改造的DNA（称为DNA模板）递送到T细胞中，构建CAR-T细胞。然而，制造大量可用于治疗的病毒载体一直是细胞疗法的主要瓶颈。
2022年，加州大学研究团队利用CRISPR-Cas9 技术制造CAR-T细胞，给这些T细胞装备上特殊的DNA序列，使它们能识别并攻击特定的癌细胞，再把改造过后的T细胞注射回病人身体来消灭癌细胞。用这种方式构建细胞，具有低毒性、高效、并且无需借助病毒的优点，预示着CRISPR-Cas9技术在癌症治疗方面具有无限的潜力。更进一步，CRISPR技术还能应用于治疗病毒感染性疾病（Frangoul H, et al. 2021），如ADIS/HIV-1、单纯疤疹病毒-1(herpes simplex virus-1,HSV1)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)等（范子豪等 2023）。
此外，现下的研究在CRISPR 系统的 sgRNA 的优化、PAM 修饰、crRNA 优化等方面的突破，也会进一步提高其编辑范围及特异性，并降低脱靶率。Cas蛋白家族中，经过改造和继续发现的多种其他Cas蛋白能满足不同的编辑需求、适用于更多的应用场景，极大拓展了CRISPR技术的应用前景。
简而言之，未来CRISPR/Cas9技术很有可能对人类农业、医疗等方方面面带来出乎意料的惊喜与突破。虽然存在着伦理和社会问题，但随着技术的不断发展和创新，CRISPR技术作为基层技术支持，极有可能成为具有划时代意义的生物技术。
项目海报
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参考文献
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