西北农林科技大学段金友团队，在高效根除耐药细菌及其伤口感染应用上取得重要进展，相关成果以“A 0D-2D Heterojunction Bismuth Molybdate-Anchored Multifunctional Hydrogel for Highly Efficient Eradication of Drug-Resistant Bacteria”为题，发表于本领域重要学术期刊ACS Nano (影响因子17.1)，西北农林科技大学为该研究的独立完成单位。
由于抗生素的滥用，越来越多的致病性细菌对抗生素产生了耐药性。耐药菌感染被认为是一个主要的公共卫生威胁。亟需开发出“非抗生素”的策略以对抗由耐药菌引起的相关感染。近年来，依赖于光敏剂对光吸收的光动力（PDT）和光热（PTT）协同治疗策略，即光热/光动力疗法（PTT/PDT），在对抗耐药菌感染方面受到了广泛的关注。由于细菌感染的特殊的微环境（低pH、缺氧和高H2O2），抑制了光动力治疗过程中ROS的产生，因而单模态PDT的抗生物膜作用仍不理想。基于此，利用病理微环境实现原位O2供应，是缓解乏氧、增强PDT抗菌和抗生物膜效应的一种切实可行的策略。同时，细菌感染的微环境通常伴有高水平的炎性细胞因子和ROS，引发免疫稳态失衡，从而延迟愈合过程，并可能增加严重并发症的风险。因此，耐药细菌感染的理想治疗不仅需要消除已形成的生物膜，还需要减轻微环境的炎症反应，及时重塑伤口免疫稳态，从而有效加速愈合过程。
针对上述挑战，西北农林科技大学段金友团队受“缺陷增强的光催化性能”和“表面粗糙度可改善细菌捕获”的启发，基于纳米结构单宁酸(TA)包被的纤维素纳米晶体(CN)杂化物(CT)，纳米光敏剂pMBO和聚乙烯醇(PVA)，构建了CPTB@pMBO水凝胶用于快速消毒和加速耐药菌感染的伤口愈合。CPTB@pMBO水凝胶具有持久的自粘性、高的机械强度和通过形成氢键和可逆的动态硼酸盐键而快速自愈合的能力。由于CPTB@pMBO水凝胶的高光热转换效率，可在可见光照射下从CPTB@pMBO水凝胶中释放出pMBO。由于其丰富的空位和异质结结构、正电荷的粗糙表面，pMBO具有优异的杀菌性能。更关键的是，Bi4MoO9纳米颗粒可以在自然光中发出荧光，使光敏剂分子（纳米片Bi2MoO6）从基态切换到激发态。双光驱动（荧光辅助可见光）光敏剂产生的氧活性物质可进一步与相邻的H2O2和O2反应，产生ROS（1O2，•O2-，•OH），用于耐药细菌细胞结构的氧化降解。同时，CPTB@pMBO可以在细菌感染的微环境（低pH和高H2O2）中清除H2O2产生O2，从而缓解缺氧微环境并增强PDT（方案1）。
方案1. CPTB@pMBO水凝胶的合成示意图及CPTB@pMBO水凝胶协同抗菌治疗和修复细菌感染伤口的机理。
如图1和图2所示，一方面，在耐药菌感染的微环境（酸性和H2O2）中，CPTB@MBO中的pMBO能够消耗H2O2产生O2，从而缓解由耐药菌感染引起的伤口部位缺氧问题。可见光照射后，持续的O2供应进一步提高光敏剂pMBO产生氧活性物质（1O2, •O2-, •OH）的水平，且pMBO具有良好的光热效应，通过O2增敏PDT和PTT的协同抗菌作用，实现有效的细菌灭活和生物膜清除。
图1. CPTB@pMBO水凝胶的光热和光动力学性能表征。(a) CPTB@ pMBO水凝胶的吸光光谱。(b) 红外热相机监测不同样品在70 min可见光照射下随时间的光热曲线。(c, e) 含不同浓度pMBO的CPTB@pMBO在70 min可见光照射下的光热曲线及相应的红外热图像。(d) 在可见光下照射时，CPTB@pMBO水凝胶（400 μg mL−1的pMBO）在照射时的温升和冷却曲线。(f) 不同治疗组小鼠的红外热像图。(g-h) 从冷却阶段计算出的室温和小鼠背部体温在冷却时间与−（ln，θ）之间的线性关系。(i-j) CPTB@pMBO在可见光照射下通过光热效应引发水凝胶液化的照片及相应的示意图。(k) 通过电子自旋共振（ESR）试验检测CPTB@pMBO的ROS。(l) 60 min可见光照射后ROS的荧光强度。(m) 与CPTB和CPTB@pMBO孵育后的过氧化氢清除行为。(n) 在不同的pH值下，与CPTB@pMBO（400 μg mL−1）共孵育后，在过氧化氢溶液（100 μM）中溶解的O2水平。(o) 可见光照射CPTB@pMBO对O2增强PDT的机理示意图。
图2. 双光−驱动的抗菌和生物膜去除能力测定。 (a-b) CPTB，pMBO 和 CPTB@pMBO (400μg mL-1的 pMBO)对 MRSA菌株和 ESBLs-Eco.菌株的光驱动抗菌作用。(c) 材料（CPTB、Bi2MoO6、Bi4MoO9、MBO、pMBO和CPTB@pMBO）在孵育8h后对MRSA的抑菌活性。(d) 在没有催化剂、0和60 min可见光照射下，在没有CPTB、pMBO和CPTB@pMBO的情况下，镀上MRSA菌落的照片。(e) 研究了不同浓度下该材料对MRSA的抑菌活性。(f) 不同温度下（25−60°C）的MRSA失活。(g) 当温度低于30℃时，Bi4MoO9、Bi2MoO6、CPTB@pMBO和MBO对MRSA的杀菌效率曲线。(h) 在可见光照射下，用CPTB@pMBO连续四次进行MRSA光失活。(i) CPTB@pMBO反应前后的FT-红外光谱。(j) 经CPTB@pMBO处理的MRSA生物膜的结晶紫（CV）染色。(k) 用60 min可见光下MTT法检测MRSA的活性。(l) 在可见光照射下，CPTB@pMBO去除生物膜的示意图。(m) CPTB@pMBO和氨苄西林、苯唑西林、青霉素和头孢西丁在60 min可见光照射下的协同灭菌能力。(n) CPTB@ pMBO +氨苄西林在可见光下的循环抗菌性能。(o-p) MRSA和ESBLs-Eco.在OD值为260 nm处的吸收值。(q) 有或无60分钟可见光时抗生素的光降解。
如图3所示，pMBO具有正电荷和大比表面积的特性，可以在ROS破坏范围内快速捕获和富集细菌。具有缺陷和异质结的pMBO允许双光驱动的治疗策略来根除具有代表性的耐药革兰氏阴性菌（ESBLs Eco.）和(MRSA)。当与抗生素协同作用时CPTB@pMBO能有效提高细菌膜在可见光刺激下的通透性，逆转抗生素耐药性。
图3.CPTB@pMBO（400 μg mL−1 of pMBO）在60 min可见光照射下的灭菌机理研究： (a) 不同处理组在60 min照射后MRSA的ONPG水解。(b) CPTB@pMBO处理MRSA的ROS强度增加。(c) 不同治疗组的f型ATP合酶活性。(d) MRSA菌株和ESBLs-Eco.菌株的SEM图像。(e) pMBO 处理 MASR 和 ESBLs-Eco. 混合菌株在0和10min 可见光照射下的 TEM 图像。(f) 不同治疗组后MRSA的碘化丙啶（PI）和4‘-6-二氨基-2-苯林多尔（DAPI）染色。
如图4所示，另一方面，实现耐药菌和生物膜清除过后，CPTB@pMBO通过pMBO的ROS清除和O2产生，可以抑制促炎因子（IL-6、TNF-α）的分泌，有效改善炎症状态。同时，O2供应可抑制LPS激活的M1表型巨噬细胞过表达，从而促进M1表型巨噬细胞向促再生M2表型极化。同时，CPTB@pMBO能够清除活性氧来减轻氧化应激，促进成纤维细胞活性，调节胶原沉积，并通过减少MMP-2和MMP-9的表达来重构细胞外基质。
图4. (a) 第3天炎症因子（IL-6和TNF-α）的定量数据。(b) 伤口皮肤组织中3、7d后基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA的相对表达量。(c) 在不同的样本下暴露7天后，皮下肌肉组织的IL-6和TNF-α的免疫组化染色。(d) 巨噬细胞中细胞内ROS和缺氧水平的代表性荧光图像。(e) DCF和[Ru（dpp）3]2+的荧光强度。(f) 术后第7天，对创面表面生物标志物M1（CD86和iNOS）和M2（CD206和Arg-1）巨噬细胞进行免疫荧光染色的代表性图像。(g) 抗炎药和巨噬细胞重编程的潜在机制示意图。
最后，在MRSA引起的相关的感染动物模型中，可见光照射的CPTB@pMBO 有效清除了细菌感染部位的生物膜及周围组织残留的细菌，从而降低中性粒细胞浸润水平，降低促炎因子的分泌（图5）。
图5. CPTB@pMBO水凝胶在体内促进伤口愈合的抗感染作用。 (a) MRSA伤口感染模型构建及治疗策略示意图。(b) 第0、1、3、5、7天不同治疗后伤口闭合的照片和示意图。(c) 伤口闭合面积百分比的量化。(d) 7天内不同组间伤口大小的变化。(e)第1、第1天、第7天伤口组织H&E染色图像。
综上所述，研究人员阐述了CPTB@pMBO在耐药细菌感染的伤口愈合中的作用机制，其优异表现可以归因于以下机制:1) CPTB@pMBO水凝胶中pMBO具有正电荷和大比表面积的特性，可以在ROS破坏范围内快速捕获和富集细菌；2) 具有缺陷和异质结的pMBO允许双光驱动策略来根除具有代表性的耐药菌（ESBLs Eco.和MRSA）。3) 当与失效的抗生素协同作用时CPTB@pMBO能有效提高细菌膜的通透性，逆转抗生素耐药性；4) CPTB@pMBO水凝胶能够减少IL-6和(TNF)-α的表达来减轻伤口部位的炎症；4) CPTB@pMBO水凝胶能够清除活性氧来减轻氧化应激，促进成纤维细胞活性，调节胶原沉积，并通过减少MMP-2和MMP-9的表达来重构细胞外基质。
论文的第一作者为王馨翎博士，通讯作者为段金友教授和王建龙教授。该研究得到了宁夏回族自治区重点研发计划项目的资助。
【作者简介】
段金友教授，博士生导师，入选陕西省‘人才计划’、教育部‘新世纪优秀人才支持计划’。博士毕业于中国科学院上海药物研究所，先后在约翰·霍普金斯大学和哈佛大学做博士后，一直致力于病原菌或共生菌与宿主的互作开展相关研究，相关成果在Cell hostµbe、PNAS、Nature Communications、ACS Nano等上发表论文80余篇。
王建龙教授，博士生导师，国务院政府津贴获得者。曾入选陕西省青年科技新星、教育部新世纪优秀人才、陕西省创新人才推进计划中青年科技创新领军人才等计划，荣获第十三届陕西青年科技奖以及陕西省杰出青年基金资助。入选2017年度英国皇家化学会『Top 1%高被引中国作者』榜单，以及斯坦福大学发布的全球前2%科学家榜单（2019 World top 2% scientists，Stanford University）。近年来主要从事食品安全危害因子快速检测与高效控制技术研究，以通讯作者或者第一作者发表论文共计120余篇，其中中科院一区论文80余篇。
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参考文献：
Xinling Wang, Qiulei Li, Yu Miao, Xueqing Chen, Xinyu Zhang, Jingru Shi, Fang Liu, Xueqing Wang, Zehao Li, Yuxin Yang, Xiuyun Zhang, Jianlong Wang, and Jinyou Duan, A 0D-2D Heterojunction Bismuth MolybdateAnchored Multifunctional Hydrogel for Highly Efficient Eradication of Drug-ResistantBacteria, ACS Nano,
DOI:10.1021/acsnano.3c02304
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c02304
来源：课题组供稿
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