疫苗的接种位置以及投递方法，与其免疫提呈和应答的的效果密切相关。大多数疫苗制剂都需要通过局部作用，如肌内注射、皮肤接种以及吸入等，达到系统免疫的效果，而且要求通过一次或数次免疫便能终身受益，因而对于疫苗制剂及投递技术就提出了很高的要求，需要针对复杂的生物学机制进行精准设计，实现靶向、缓释、跨膜、响应等特殊功能。此外，疫苗作为生物制品，其生产的工艺、稳定性和质量标准也颇为特殊，需要在制剂的开发中加以考量。
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疫苗制剂及其免疫应答机制
疫苗是现代医学取得的最伟大的成就之一，但疫苗学和免疫学在过去200多年的历史中，虽有交叉却各有不同的发展轨迹。科学家们通过经验性研究，获得了一系列可接种于人类的疫苗，成功地阻止了多种烈性传染病的肆虐，但对于如何最有效地通过疫苗的作用诱导保护性免疫应答，却并不清楚。针对有些病原体如HIV等的疫苗研究进展缓慢，亟需研究者们从免疫应答的机制出发，加深认识，以促进更合理更有效的疫苗研究。
天然病原体感染机体后，诱导免疫应答和被清除的过程是一个精确而又复杂有规律的过程。病原体入侵机体初期，可被局部的巨噬细胞、血管中的中性粒细胞或其他固有免疫细胞吞噬、处理和清除；另外，活化的吞噬细胞还可产生大量的细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子等引起炎症反应，促进病原体的清除。
一般的病原体感染或可就此终结，但如果机体中的病原体还没有被清除干净，便会诱导机体产生特异性免疫应答：活化的抗原提呈细胞可将加工处理过的抗原以MHC-I类或MHC-II类分子复合物的形式表达于细胞表面，提呈给淋巴细胞，T细胞在双信号的刺激作用下，增殖分化并且活化其他免疫细胞共同保护机体，包括产生特异性细胞免疫反应，最终清除受感染的细胞，而B细胞则在抗原刺激作用下及Th细胞的帮助下增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体，诱导机体液免疫应答。在免疫反应的最后阶段，大部分活化的B细胞和T细胞都趋于凋亡，只有少数作为记忆细胞保留下来应对机体再受到相同的病原体感染(PulendranandAhmed，2011)。
成功的疫苗接种，需要模拟上述复杂应答过程的每个关键环节，特别是包括固有免疫(innateimmunity)和适应性免疫(adaptiveimmunity)两种机制的协同作用。
目前成功用于人体的疫苗，如第一类灭活疫苗(包括甲型肝炎疫苗、狂犬病疫苗等)和第二类减毒活疫苗(attenuatedlivevaccine)(包括天花疫苗、黄热病疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、水痘疫苗等)，由于在疫苗制剂中保留了完整的病原体，包括各种病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular pattern，PAMP)，所以能够较全面地激发免疫应答。其中，灭活疫苗由于没有增殖能力，对机体刺激的时间较短，所以可能需要多次重复接种；而减毒活疫苗由于微生物接种后在体内有生长增殖能力，接近于自然感染，即与机体受到感染而诱导保护性免疫的过程类似，所以大多数只需要一次免疫，即可使体内的免疫应答和免疫记忆维持数十年之久(Plotkin et al. ， 2008)。
近年来，研究者们深入研究了多个具有优异保护功能的灭活疫苗和减毒活疫苗的作用机制，以期对其中的关键因素有系统的认识。研究表明，病原体的PAMP可有效地被体内APC识别，通过多种不同的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，包括Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)等激活信号传导，诱导体液免疫和细胞免疫的产生。如黄热病疫苗YF17D能高效激活浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)和髓样树突状细胞(myeloiddendriticcell，mDC)上的多种TLR，包括TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，诱导混合型的Thl细胞和Th2细胞反应(Querec et al.，2006)。流感病毒则通过TLR7激活pDC，通过IPS-1激活mDC(Koyama et al.，2007)。
更重要的是，研究表明，特异性抗体和细胞免疫作用的产生和记忆，特别是免疫应答的强度和效力，与疫苗免疫应答中固有免疫机制的参与密切相关，如采用灭活的全病毒疫苗时，需要TLR7介导的pDC分泌的I型干扰素参与，才能保证免疫应答的效力(Koyama et al.2010)。
上述疫苗免疫应答中关键因素的研究，对于新一代疫苗的开发有重要的指导意义。相对于早期的第一代灭活和减毒活疫苗，更为先进的疫苗制剂(第二代疫苗)有亚单位疫苗(subunitvaccine)，如重组乙肝疫苗；类毒素疫苗(toxoid vaccine)，如白喉疫苗和破伤风疫苗；多糖疫苗(carbohydratevac-cine)，如肺炎疫苗和b型流感嗜血杆菌疫苗；结合疫苗(conjugatevaccine)，如脑膜炎疫苗等。而第三代疫苗主要是编码了病原体基因的DNA疫苗和重组病毒载体疫苗(如腺病毒载体疫苗)等，由于只包含了病原体中的部分抗原物质信息，没有感染活性。
越来越多的研究考虑到安全因素，希望在疫苗中避免使用病原体来源的物质，从而在体内应用时更为安全，在生产和制备工艺上也避免了大量病毒体外培养的步骤，更为高效经济。但是，由于它们缺乏病原体中很多原有的PAMP等，常常不能最有效地激活免疫系统，所以需要通过疫苗制剂处方的设计和优化，如加入一些能够增强免疫应答、被统称为佐剂的物质，或者通过特异性针对抗原提呈细胞的接种方式和载体技术等，对免疫应答进行有效调控，获得高效的免疫应答和保护作用。
所以，不同疫苗制剂的处方，包括特定佐剂和靶向输送载体的应用、接种方式、给药形式和抗原释放特征等，对疫苗激发的固有免疫应答、抗原提呈过程，以及特异性免疫应答的效力都有重大影响。本文将从疫苗接种方式、投递技术、输送载体等角度进行讨论。
图1.DNA疫苗肌内注射和电脉冲作用下肌内注射后的肌细胞结构分析
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疫苗的接种方式
疫苗的接种方式很多，包括口服、滴鼻、鼻内喷雾、肌内注射、皮下注射、皮内注射等，此外，还有肺吸入、微针透皮、电脉冲导入、超声透皮、淋巴结注射、口腔黏膜给药等各种传统和正在研发中的新型给药方式。疫苗接种方式的选择，并不是随机的，除了疫苗应用的顺应性和实用性的考量外，还必须基于期望的免疫应答的原理，有效地激发固有免疫和获得免疫应答的协同作用，促进抗原识别和提呈的效率，并获得理想的体液免疫和细胞免疫应答作用。针对不同的疫苗接种方式，其免疫应答和抗原提呈机制简单讨论如下。
2.1
肌内注射
大多数灭活疫苗都是通过肌内注射接种的，通常是在上臂的三角肌，如甲肝疫苗(hepatitisA vaccine)、狂犬病疫苗(rabies vaccine)及灭活的流感病毒疫苗等。此外，还有一些亚单位疫苗，如HPV疫苗和很多研发中的DNA疫苗等。
对于大多数肌内注射的疫苗，体积较大的肌肉组织相对于皮下组织能够接受更大的注射体积，而且可以多次接种。同时，肌内注射制剂中常常添加了佐剂，对肌肉组织的刺激性较小，但注射部位的选择和准确性都对免疫效果有影响。
对于只是编码了抗原信息的DNA疫苗和重组病毒载体疫苗(如腺病毒载体疫苗)，肌肉组织的作用就不仅仅是暂时容纳疫苗溶液，而是需要作为抗原的生产工厂，甚至是抗原提呈的孵化器。研究者曾经对DNA疫苗通过肌内注射接种的作用机制进行了深入研究认为，DNA质粒可能在肌纤维膜受到破坏、肌细胞再生的过程中，被新生肌细胞摄取，并能长期持续表达(Peng et al.，2005)。同时，局部损伤也激活了多个趋化因子基因的表达，起到了招募单核细胞和树突状细胞的作用，促进了抗原摄取和免疫提呈。
研究者提出，可以将一定电压的电脉冲局部作用于肌肉组织。电脉冲的作用扩大了肌纤维膜损伤的范围，以及局部的炎症因子和趋化因子的表达，进而增强了DNA疫苗的摄取、表达和抗原提呈的效率(Peng et al.，2005；Peng et al.，2007)。DNA 疫苗肌内注射和在电脉冲作用下肌内注射后不同时段切片分析获得的肌细胞结构图(图5.1)，反映了肌纤维损伤后单核细胞浸润、肌细胞再生、纤维重新形成的过程。这一过程持续14天左右，同时也完成了抗原表达、提呈以及免疫应答的一个周期。
2.2
皮下注射
皮下疫苗接种是指将疫苗注射到皮肤与肌肉之间的组织中。一般婴儿的注射部位为大腿部，儿童和成人为上臂外侧，常见的通过皮下注射接种的疫苗有麻疹疫苗、乙脑疫苗、流脑疫苗、风疹疫苗等。
皮下接种的疫苗能够作用于引流淋巴结中储留的树突状细胞，以及皮肤来源和单核细胞分化来源的髓样树突状细胞(mDC)，诱导抗原提呈。近年来，有一些研究希望通过优化皮下接种疫苗的抗原提呈过程，提高免疫应答的强度、增强保护性免疫和促发免疫记忆的产生。研发的相关技术有采用抗原缓释微球、组织工程支架材料以及水凝胶等，并且在处方中加入一些免疫刺激因子，如细胞因子或趋化因子等所谓分子佐剂，希望对抗原提呈和免疫应答过程进行调控。此外，有研究尝试用控制一次给药的抗原释放替代常规的多次和加强免疫周期，希望通过一次接种获得长期甚至终身的免疫效果，从而大大提高疫苗的顺应性和实用性。
这些思路已经突破了简单的疫苗接种制剂的概念，而把疫苗作用作为一个系统工程，其设计思路立足于人们对于免疫应答机制的认识，所以被认为是未来更高效和安全的疫苗制剂发展的重要方向。但实施中必须解决的重要问题是如何通过材料和制剂的设计，实现严格的抗原和细胞因子的控制释放，从而更契合天然的免疫应答原理，增强抗原特异的保护性免疫，而没有免疫耐受或者激发炎症反应的隐患。
2.3
皮内注射及微针技术
皮肤是人体抵御病原微生物入侵的重要器官，表皮层富含一种骨髓来源的树突状细胞，叫作朗格汉斯细胞(Langerhanscell，LC)，LC是非常有效的抗原提呈细胞。此外，还有真皮层的皮肤树突状细胞(dermal dendriticcell，dDC)，也能参与识别和提呈外来抗原。国际卫生组织资助的研究证实，皮内注射疫苗不仅有可能提高疫苗的效果，还可以减少注射的剂量，如流感疫苗和狂犬病疫苗皮内免疫，仅使用10%~20%的抗原量就能引起与肌内注射免疫或皮下注射免疫相同的免疫应答效果。
但疫苗的皮内注射需要一定的技巧，该方法被称为曼托克斯方法(Mantouxmethod)，要求皮肤舒展，针头平行皮肤表面刺入皮肤。该技术被用来进行卡介苗和狂犬病疫苗的皮内接种，但如果用于人群的大规模免疫有一定难度。所以研究者们一直在孜孜不倦地探索各种不用针头(needleless)的皮内免疫接种方法，包括使用微针技术、促透剂、胶带剥离、超声作用、电渗流等。其中被认为最有开发前景的，是微针技术在疫苗接种中的应用。
微针是一种类似注射针头的微米级空心或实心针，通常被加工成微针阵列(microneedlearray)，可以制成各种各样的规格，长短在25~1000μm。由于人类角质层的厚度为10~15μm，微针可在皮肤上创造出许多微小的输送通道，使亚单位蛋白疫苗等能够有效地穿透角质层到达表皮层，从而被LC和dDC摄取，见图2。此外，微针给药操作方便，即使是非医护人员也很容易完成，而且使用微针无痛、无感，具有很好的顺应性。
图2.电子显微镜下单个微针作用后在皮肤表面形成的通道
2.4
口服疫苗
据估计，有70%的病原微生物是通过黏膜系统入侵宿主，包括对健康危害极大的传染病，如流感、结核、沙门菌病等。人体的免疫系统中针对黏膜免疫有专门的组织结构和应对机制。黏膜免疫系统(mucosal immune system，MIS)亦称黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue，MALT)，包括黏膜固有层和上皮细胞下散在的淋巴组织，以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派尔集合淋巴结(Peyer patches，PP)和小的淋巴滤泡等。
以消化道黏膜反应为例，M细胞(membranous epithelial cell或microfold cell，膜上皮细胞或微皱褶细胞)是特殊的上皮细胞，能进行抗原转运，其顶部胞质较薄，细胞核位于基底部，细胞基底部质膜内陷成凹腔，内含有淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞。M细胞能够将肠腔颗粒物或者蛋白质摄取进入凹腔，在凹腔中抗原被储留的抗原提呈细胞摄取吞噬(Kraehenbuhl and Neutra，2000)。同时，黏膜固有层中的树突状细胞也能够把树突触角透过上皮细胞到肠腔中进行抗原筛选提取。
抗原提呈后，激发B细胞和T细胞的活化，活化的淋巴细胞穿过淋巴结进入血液，通过淋巴细胞归巢受体作用转移到特定的黏膜效应位点，发挥黏膜免疫效应。
体液免疫是黏膜免疫的重要部分，IgA抗体可以穿过黏膜上皮与膜表面相应受体结合而分泌到肠腔中去，不易被蛋白酶降解，因此，在消化酶存在下也可以中和抗原和毒素，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等抵御病原体及有害物质入侵的第一道免疫屏障。此外，T细胞和上皮细胞分泌的细胞因子如TGF-B、IL-10、IL-6在活化能分泌IgA的B淋巴细胞中也起着重要作用。同时，体内产生的系统免疫应答，包括IgG以及细胞毒性T细胞等，也可以作用于黏膜组织，有利于对疾病的控制。
由于黏膜免疫应答的独特性，对于首先感染黏膜组织的病原微生物，最理想的免疫途径是直接将疫苗接种到黏膜表面，目的是诱导黏膜免疫和系统免疫均衡作用的全面的免疫应答。胃肠道、鼻腔、呼吸道以及生殖道黏膜都被认为是可能的接种位点，其中口服接种是最容易被大众接受的方式。
但由于胃肠道的微环境对没有保护的灭活病毒和蛋白抗原都不友好，所以目前已上市的口服疫苗，都是减毒活疫苗，包括口服轮状病毒活疫苗(liveoral rotavirus vaccine)，伤寒疫苗(typhoid vaccine)和口服脊髓灰质炎病毒活疫苗等。但与灭活疫苗或亚单位疫苗相比，减毒的病原体存在与致病病原体整合的风险，也可能有其他不良反应。例如，在美国，口服脊髓灰质炎病毒活疫苗由于在个别病例中能引起疫苗相关的麻痹性脊髓灰质炎，已被停止使用，而改用注射的灭活病毒疫苗。另有一个口服轮状病毒活疫苗Rota-Shield在临床实验也曾因引起肠套叠的个例而被召回。
为了研发更安全的口服疫苗，研究者们一直尝试用制剂的方法保护抗原，如使用可降解的聚合物或脂质载体保护抗原等。但在一个初步的临床实验中，用脂质载体包裹的破伤风类毒素(tetanus tox-oid，TT)或者白喉类毒素(diphtheria toxin，DT)口服给药，人体中产生的血清抗体滴度远低于基于动物实验的预期，所以还需要进一步进行制剂优化。研究者曾报道过用古菌(archaea)中提取的四酸脂质作为载体的材料(Li et al.，2011)，这些脂质分子层的排列非常致密，在胃肠道酸性条件以及各种消化酶存在的条件下，也能有效地保护抗原的完整性，而且将抗原以颗粒形式提呈给肠道黏膜相关淋巴组织，在小鼠实验中有较好的黏膜免疫效果，但还没有在大动物模型中的数据支持。
近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究将抗原的DNA信息克隆到各种质粒、病毒载体中，进行接种。对于口服接种各类DNA疫苗制剂，其挑战不仅是保持抗原信息的稳定性，还往往需要通过转染肠道上皮或上皮相关淋巴细胞，表达抗原并被人体的免疫系统识别。所采用的病毒载体有重组腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxvirus)、流感病毒(influenzavirus)、疱疹病毒(herpes virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)等，但这些载体本身的免疫原性对大多数预防性疫苗应用的安全性是一种隐患。而基于壳聚糖、脂质分子等的非病毒载体，虽然相对安全，但其有效性还有待突破。
还有一些研究，采用了转基因植物、益生菌(如乳酸杆菌)(Lei et al.，2011)或减毒菌株(如沙门菌、大肠杆菌、李斯特菌等)表达抗原并作为载体投递疫苗。这些载体由于本身能像天然佐剂一样为机体提供PAMP，激发DC的成熟与活化，所以理论上应该有较好的免疫效果。但在实际研究中，研究者们也发现机体对载体的免疫应答往往更占优势，并且由于细菌中表达的抗原没有糖基化位点，所以产生中和抗体的效价并不高。所以这一领域的大多数研究也都停留在动物实验阶段。
此外，除去口服后作用于胃肠道的疫苗制剂，也有一些其他经口免疫的尝试，包括口腔、舌下、牙龈等，都被认为是有潜力的免疫部位。这几个途径给药不会有胃肠道相关的降解和耐受问题。在小鼠模型中，舌下给霍乱毒素(choleratoxin，CT)2小时后，在舌下黏膜表达MHC-II类分子的细胞数明显增多。而通过舌下途径给予小鼠含有CT佐剂的人乳头瘤病毒样颗粒(VLP)，可以在血清中诱导产生HPV的中和抗体，在生殖道中也能检测到病毒特异性抗体。但在人体实验中，舌下免疫途径常常用来治疗特定的过敏反应，是否能有效地诱导保护性免疫原性还需要深入研究。
2.5
鼻内免疫
鼻相关淋巴组织位于大型哺乳动物鼻咽上部和咽隔的尾端，通过鼻孔进行鼻内黏膜免疫其实是一种可行的免疫方法。鼻黏膜与胃肠黏膜相比，不具有酸性，没有丰富的酶类。鼻黏膜面积小，因此免疫抗原的用量较少，而且鼻黏膜方便疫苗接种，适合大量人群的使用。研究表明，鼻内免疫接种既可以诱导黏膜免疫反应，也可诱导系统免疫反应，包括远程黏膜部位，如呼吸道和泌尿生殖道的免疫应答。目前，最成功的鼻内疫苗还是减毒活疫苗，例如FluMistT为一种减毒的流感疫苗，用以鼻内给药，其效果、免疫原性、安全性在年龄从15个月大的儿童到成年人群中都得到了确认，在儿童中对预防流感病毒的有效性高达93%。通过鼻内免疫接种白喉疫苗、破伤风疫苗以及变形链球菌疫苗等也都得到了类似的结论。
但另外一种用于鼻内免疫接种的流感减毒活疫苗Nasalflu在瑞士被批准使用后，被发现有可能引发贝尔氏麻痹症(Bell'spalsy)，估计可能与使用了大肠杆菌的不耐热毒素(LT)作为佐剂有关，所以已被撤出市场。
除了减毒活疫苗，也有很多的研究尝试将体外表达的亚单位抗原、病毒样颗粒和DNA疫苗载体等制成鼻内接种的制剂，通过优化处方和载体设计改善抗原在鼻腔黏膜上的稳定性和保留时间，增加鼻相关淋巴组织(NALT)对抗原的摄取量，同时还需要通过佐剂的作用激活免疫应答。
2.6
肺吸入
黏膜免疫的另外一种重要途径是气雾剂疫苗接种，被认为是一种很有前途的无针疫苗接种方法，尤其适合对儿童或人口较多的发展中国家进行大规模的疫苗接种。气雾剂疫苗接种的目的是把疫苗投递到各支气管包括肺泡等组织，这种接种方式很好地遵循了许多肺部疾病自然感染的途径，在病原体进人机体的初始部位形成防御和保护。
但是肺部免疫方法至今在临床上还没有被广泛使用，其中一个原因是缺少能够高效给药但又确保安全的设备。目前常用的是雾化器，在一项墨西哥学生的麻疹疫苗吸入实验中，研究者在雾化器中装人大约够免疫45个儿童的疫苗量，每个儿童吸入气雾剂疫苗30秒，然后更换一次性口罩。虽然实验表明，这一方法对接种人员和接种者都是安全的，儿童出现咳嗽、鼻炎、发热、腹泻、皮疹、结膜炎等症状的频率比注射也明显降低，血清转化率也明显高于皮下注射给药，但是研究者们还是希望能发展更为安全和有效的肺部免疫方法。
研究者认为，理想的肺部免疫制剂应该使用定量吸入装置(metereddoseinhaler)，如喷雾剂和粉雾剂等，以便能够更准确地针对呼吸道黏膜组织，给药剂量也更可控，而且更为环保和安全。此外，还希望能够采用更为安全的亚单位疫苗，甚至DNA编码的疫苗，以及配合能够有效刺激免疫应答的佐剂一起使用。
2.7
其他黏膜免疫方法
目前研究中的其他黏膜免疫方法包括经眼结膜(ocular)和阴道(vaginal)给药等，目的都是诱导产生在黏膜表面或局部的免疫应答。
3
疫苗投递技术
随着人们对疫苗的组成和免疫应答过程认识的不断深入和日益定量化，基于科学原理、以设计为基础、利用工程分析的方法研制疫苗产品的体系逐步成熟。疫苗工程学这个新兴领域旨在提供一系列新方法，以便更好地理解、应用人体的免疫应答过程，使疫苗设计朝着合成、定量和转化的方向发展。特别是由于近年来有多种肿瘤免疫治疗的临床应用效果提示，治疗性疫苗在特定条件下可能彻底治愈肿瘤，所以研究者们对各种各样的针对肿瘤抗原的疫苗设计充满了热情。例如，以电子技术和新型生物材料为基础的疫苗载体和佐剂的设计(Yang et al.，2015)，靶向免疫器官及免疫细胞的抗原输送和提呈，不同免疫激发和调节机制的有机结合等，都是疫苗工程学的研究热点。
3.1
疫苗的微纳米粒子载体
不同大小和不同表面性质的纳米粒子，作用于免疫系统，具有多样的作用机制，如促进抗原提呈、激活趋化因子、招募免疫细胞、协助淋巴细胞归巢等。
脂质体(liposome)是由磷脂和类脂分子组装形成的双层膜囊泡，基于脂质体结构的微纳米粒子兼具疫苗载体、佐剂以及细胞内输送等多重功能，在疫苗制剂中应用广泛。如通过重组流感病毒的部分膜蛋白在PC或PE脂质膜上形成的免疫增强性重组流感病毒体(immunopotentiating resconstituted influenza virosomes，IRIV)粒径约为150nm，具有良好的免疫刺激效果，已被应用于欧洲上市的流感疫苗和甲肝疫苗的制剂中。其中，甲肝疫苗由于使用IRIV，避免了铝佐剂，所以被认为相对于灭活疫苗具有更好的安全性和生物相容性。此外，也有研究指出，在脂质膜处方中可以加入类脂A(lipidA)或胞壁酰二肽(muramyldipeptide，MDP)的衍生物等，这些分子都可以强烈刺激固有免疫和获得免疫应答，进而提高疫苗效果。第三类是有些pH敏感脂质体和阳离子脂质载体具有良好的内吞体逃逸功能，能够帮助抗原内吞后被释放到细胞质，从而进入MHC-I类分子途径，通过交叉提呈同时激发体液免疫和细胞免疫。
聚合物微球是另一类被广泛研究的疫苗载体，微球的材料可以有各种来源，包括壳聚糖、海藻酸钠、PLGA等聚合物微球，或其他有机或无机的固体颗粒。微球的作用主要是作为抗原的载体，通过包裹、吸附等作用，装载多种抗原，作为储库缓慢释放抗原，减少免疫次数，提高免疫的顺应性和效果。此外，研究者们还可以通过调整微纳米粒子的大小、表面电位等，调控它们与免疫细胞的作用，如表面吸附有抗原的直径为1μm的粒子可以刺激CD8T细胞应答，直径小于0.5μm的纳米粒子在将MHC-I类分子抗原提呈到T细胞方面的作用却是低下的，更小的粒子(0.04~0.05μm)则能更有效地将抗原输送到抗原提呈细胞(APC)，产生强有力的体液免疫应答和CD8*T细胞免疫应答。这类研究虽然有众多报道，但临床研究还十分有限，有关材料、粒径大小等与免疫应答机制的直接因果关系，还需深入研究。
此外，还有些特定结构的粒子如ISCOM和VLP等，不仅是抗原的载体，而且由于其中包含了病毒来源的分子或结构，能够有效刺激细胞因子IL-1和IL-6的分泌，促进B细胞和T细胞的增殖等。ISCOM 是由皂苷(植物皂苷)、脂质、胆固醇和抗原组成的一个直径为40nm的粒子，其中皂苷具有明确的免疫促进作用。基于ISCOM结构，ISCOMA-TRIX@可以直接加入抗原溶液中，起到类似的佐剂作用，与抗原溶液混合使用。
病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)是指不含病毒基因组的空壳或包膜状颗粒结构，是由病毒的结构蛋白组装形成的介于15~400 nm的空心颗粒。VLP与天然病毒颗粒结构相似，可以通过吸附或化学修饰的方法装载抗原，免疫后能够高效地被树突状细胞摄取，诱导免疫反应。将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中进行表达，表达的蛋白可以自动装配成在形态上类似于天然病毒的病毒样颗粒，如HBV表面抗原组装的VLP，已被用于乙肝疫苗的制备；人乳头状瘤病毒疫苗就是由HPV6、HPV11、HPV16和HPV18等抗原形成的VLP组成的。为了进一步提高VLP的免疫原性，也可以将佐剂吸附或连接在VLP表面，如MPL和CpG DNA，可以显著增强并调节免疫应答的强度和广度。
3.2
疫苗的靶向和交叉提呈载体
为了提高疫苗的效率，研究者们希望能够主动靶向特定的免疫组织、特定的抗原提呈细胞，甚至其中特定的细胞器。因而，诸如淋巴靶向的载体、主动作用于树突状细胞表面蛋白的载体以及交叉提呈载体，都受到了重视。例如，对于特定粒径范围内的纳米粒子，可以被动靶向到肾、肝、脾等网状内皮系统丰富的器官，并进一步作用于网状内皮组织，而停留在肿瘤组织中的纳米粒子，如果足够小(直径<100nm)，也能够在细胞间质压的作用下，通过毛细淋巴管的间隙，直接进入引流淋巴结，并根据其粒径和表面性质，作用于不同的免疫细胞，包括B细胞或功能化未成熟的APC等。
另一些研究，设计了双特异性抗体结构(bispecificantibody)，或者在脂质体表面链接具有靶向特异性的配体，可以促进抗原信息作用于抗原提呈细胞，或直接作用于T细胞并激活T细胞，达到免疫治疗的效果(Choiet al.，2013)。
在黏膜表面的抗原及其载体系统，可以通过黏膜相关淋巴组织，诱导强有力的体液免疫和细胞免疫，从而保护其免受病毒的侵害。例如，外源凝集素具有激活免疫系统的功能，可以通过与派尔集合淋巴结中的M细胞黏附加强肠道吸收；槲寄生凝集素-1(lectin-1)、番茄凝集素(tomatolectin)、菜豆凝集素、麦芽凝集素(wheatgermagglutinin，WGA)及荆豆凝集素1(UEAI)等，在小鼠实验中都被发现有助于口服接种后刺激其产生血清特异性抗体IgG和IgA。
特定载体甚至能够把抗原靶向到特定的亚细胞区域。可溶性抗原由APC收集后主要通过MHC-II类分子提呈，激活CD4T细胞，引发体液免疫应答。纳米材料可以根据吞噬体的环境(phagosomalcondition)，设计抗原交叉提呈的捷径(short circuit)。比如某些聚合物载体，在内吞体(endosome)中的pH条件下破坏膜，在还原条件下释放出抗原，或者还原嵌段共聚物形成的载体，从而释放物质，然后通过渗透压破坏内吞体。通过这些方法，抗原能够直接输送到细胞质中，在细胞质中可以像病毒一样被处理。在这样的聚合物作用下，CD8'T细胞的产量增加了一个数量级。
3.3
DNA投递技术的应用
基于DNA编码抗原的DNA疫苗的概念始于20世纪90年代初期，Wolff等人将质粒 DNA 直接注射入小鼠骨骼肌中，检测到质粒DNA的转录表达和免疫应答，提示了应用DNA作为疫苗制剂的可行性。近年来，许多研究者采用不同的质粒、不同的载体、不同的投递方式和不同的抗原基因等开展了大量研究，在动物模型中证明了DNA疫苗能有效地引起广泛的免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫，尤其是能诱导产生细胞毒性T细胞，实现保护性免疫甚至是治疗的效果。目前，已有多个DNA疫苗产品作为兽用疫苗被批准应用；在人群中的应用方面，也有多个产品进入了临床研究，前景广阔。
DNA疫苗的投递可以通过病毒载体或非病毒方法完成，可以在体外针对抗原提呈细胞投递，也可以直接给药在体内完成转染、表达以及抗原提呈的过程。最新的研究还有直接针对B细胞(Lee et al.，2008)和T细胞(Zhao et al.，2006)进行DNA或RNA投递，再通过基因编辑(geneediting)从而获得特异性免疫的尝试，其中的关键都依赖于安全高效
的DNA或RNA导入技术。
现有的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，主要的优势在于转染效率较高，但也存在着自身免疫原性的干扰、目的细胞受限以及野生重组风险等问题。此外，还有基于各类脂质和高分子聚合物材料的非病毒载体系统，但局限是转染效率和靶向性都不够理想。相较而言，基于各种物理作用的投递技术，如电脉冲(electric pulse transfer，EPT)、超声、水动力等，应用简便，技术参数的可控性强，而且对于DNA或RNA分子结构和大小均没有限制，所以越来越受到关注。
其中，最为成熟的电脉冲DNA投递技术，也被称为电穿孔(electroporation)技术，始于1970--1980年人们对电场作用下细胞脂质双层膜的结构变化的研究。研究者利用短路的电泳仪作为初始的EPT设备，之后又研制了指数衰减型的电脉冲穿孔仪，针对细菌等细胞作用导人DNA和其他分子。
目前，已有多种电投递技术在临床应用，包括在手术中利用电脉冲提高肿瘤细胞对化疗药物的摄取等。具体针对DNA疫苗的投递，已有大量研究证明，当DNA疫苗接种于表皮、肌肉等组织部位，施加电脉冲刺激可以促进抗原表达和提高免疫应答的效率，激发产生全面而持久的保护性免疫反应。其中不同强度和波形的电脉冲参数的作用可能不同，一般认为，某些电脉冲产生的组织损伤，可以帮助DNA转染进入周边的组织细胞，如肌细胞和抗原提呈细胞等，质粒DNA借助宿主细胞在外源基因启动子作用下进行编码基因的转录和翻译，使外源基因得以表达。表达的蛋白一部分在细胞内水解为抗原多肽链，与MHC-I类分子结合，被APC提呈；部分被分泌到组织间质，被电脉冲作用招募的APC吞噬、加工处理后，与MHC-I类分子或MHC-II类分子结合表达提呈，在共刺激信号的帮助下活化Th细胞，触发免疫应答(Peng et al，，2007)。基于这一机制，针对皮内作用和肌肉作用的DNA疫苗，分别设计和优化了电脉冲参数和投递装置，如应用于肌肉作用的乙肝治疗性DNA疫苗和HIV预防性DNA疫苗(Zhao et al.，2006)，通过临床实验证实了其安全性和高效提高免疫应答的效果。
基于更多应用的要求，电脉冲导入参数和设备的研发也在不断改善中，如方形波电脉冲的脉冲振幅与脉冲宽度均可以优化；靶组织和细胞的大小、形状与形态等也会影响电场的分布；针对细胞膜的作用机制，有实验表明，细胞间隙、细胞外间质的黏度、离子强度等也会影响电投递DNA的效率(Peng et al.，2014)。此外，一些小分子活性物质的佐剂和细胞活化效果，也不容忽视。
参考来源：当代新疫苗（第二版）（杨晓明 主编）
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