无污染多孔水凝胶，一步法筛选高亲和力适配子！
适配子通常被称为化学抗体，广泛应用于药物输送和生物传感。然而，适配子的选择过程构成了一个巨大的挑战，因为它需要多次的浓缩循环，并涉及非特异性结合的问题。宾夕法尼亚州立大学王勇提出了一种简单、快速的方法来浓缩和选择适配子，该方法基于三维无污染多孔凝胶中的扩散结合过程和固定的目标蛋白。低亲和力的适配子候选可以从水凝胶中快速释放，而高亲和力的候选适配子由于与固定的蛋白质靶标强烈结合而受到限制。因此，一步浓缩的适配子池可以强烈地结合蛋白质靶标。这种浓缩在五种等电点不同范围的蛋白质中是一致的。以凝血酶为代表模型，从丰富的适配子库中鉴定出的抗凝血酶适配子具有与传统方法10个循环筛选鉴定的适配子相当的结合亲和力。该研究以题为“High-affinity one-step aptamer selection using a non-fouling porous hydrogel”的论文发表在《Nature Biotechnology》上。
【建模分析】
首先用扩散结合模型评估了不同结合亲和力的适配子的三维传输行为，解离常数Kd值从1 nM到10μM。模拟分析表明，所有适配子都是从固定了目标分子的定义的多孔空间中释放出来的。适配子的浓度变化很大，中心区域浓度较高，外围浓度较低。然而，不同的适配子在空间上的分布和暂时的保留率不同。Kd为1 nM的核酸适体的保留率是Kd为1μM的46倍。因此，模型分析表明，由于耦合扩散-结合过程，具有不同结合亲和力的核酸适体在与目标分子固定的多孔空间中具有非常不同的保留率。
图1| 用于适配体选择(HAS)的水凝胶
【大孔聚乙二醇水凝胶的合成与表征】
适体选择的一个主要挑战是与选择基质的非特异性分子结合。聚乙二醇(PEG)是研究得最多的非污染聚合物。制备聚乙二醇水凝胶的方法简单且建立良好。因此，该研究合成了大孔PEG水凝胶，实验模拟了无污染的多孔空间，用于适配体的选择。这种使用合理设计的“水凝胶进行适体选择”的方法简称为HAS。多孔PEG水凝胶通过冷冻合成，该过程涉及PEG单体和交联剂在低温下的自由基聚合。同时，在水凝胶网络中形成冰晶，融化后在水凝胶结构中形成大孔隙。由于多孔结构的存在，PEG水凝胶可以吸收大量溶液，膨胀程度高。流变学数据进一步表明，由于存在大孔隙，PEG水凝胶非常柔软，存储模量为300 Pa。总的来说，这些结果表明，冷冻是一种有效的方法，可以制造出高孔隙的PEG水凝胶，并有可能被用作选择矩阵。
为了能够在三维空间中固定化蛋白质，在预凝胶液中加入了丙烯酸。聚合后，聚乙二醇水凝胶网络将与羧基结合，这些羧基可以很容易地被激活，用于使用标准的碳二亚胺化学进行蛋白质结合。在结合-扩散过程中，固定化凝血酶抑制了潜在适配子候选的扩散。该研究选择60h作为从聚乙二醇水凝胶中收集富集适配子池的截止时间点，而不进一步延长释放过程。固定化凝血酶在大孔水凝胶中达到阈值浓度对于有效地选择适配子是重要的。
图2|水凝胶表征和适配体选择
【抗凝血酶适配体表征】
使用下一代测序分析了60h从水凝胶中收集的适配子池。在这八个候选者中，T.7显示出最强的结合信号，其Kd为1.5 NM。该研究用一个简单的生物传感器来分析T.7的结合特异性。凝血酶与六种对照蛋白的比较表明，T.7显示出高结合特异性。由此可见，该研究通过一步HAS成功地发现了抗凝血酶适配子。
全长T.7适体，即T.7(90)，具有多茎环二级结构。基于该二级结构，T.7被截短以产生六个较短的适体序列。用SPR对这些截短的序列进行检验。T.7(30)和T.7(45)表现出低结合强度，而其他四个截短适体表现出与原始T.7适配子类似的高结合亲和力。这种观察是预期的，因为全长适配子同时包含必需和非必需核苷酸，并且适配子将失去与去除的必需核苷酸的结合亲和力。SPR分析表明，T.7(40)表现出与15聚体和60-18(29)相当的结合亲和力。因此，数据表明HAS在一步筛选高亲和力适配子方面是有效的。
图3| 使用一步法HAS获得的候选适配体的分析
【针对四个附加蛋白质靶标的适配体选择】
大多数蛋白质的等电点(pI)值在5到9之间。为了忠实地表明HAS可以作为凝血酶以外的其他靶标的技术平台，该研究选择了针对另外四种蛋白质的适体，其pI值范围为5至9。这些蛋白质是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) )、白细胞介素-12 (IL-12)、IL-10和脑源性神经营养因子(BDNF)，分别代表带负电、中性和带正电的分子。针对一系列具有不同电荷的蛋白质的适配体的成功选择表明，HAS方法对于发现针对不同靶标的适配体是有效的。
图4| GM-CSF、IL-12、IL-10和BDNF适配体的选择和表征
【小结】
综上所述，HAS方法简单、快速、成本低、无需仪器，可用于核酸适配体库的富集和核酸适配体的筛选。HAS在促进从药物开发到临床诊断等各个领域的发展方面具有巨大的潜力。
--纤维素推荐--
来源：BioMed科技
声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！