撰文丨郭斐、赵斐
2022年5月起，猴痘疫情在世界范围内迅速传播，截至2023年10月6日，已有115个国家向世卫组织报告了9万余例确诊病例和157例死亡病例。2023年6月以来，我国多个省份先后报告1000余例猴痘确诊病例，引发新增本土续发疫情和隐匿传播的较高风险。
猴痘是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患病，与天花病毒（VARV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VACV）同属痘病毒科正痘病毒属。自20世纪80年代在世界范围内根除天花后，MPXV成为人类最关注的正痘病毒。由于正痘病毒属表面蛋白具有较高的同源性（>90%），以VACV或改良牛痘病毒为基础的天花疫苗产生的中和抗体可以持续数十年，对猴痘提供约85%的交叉保护作用。
然而，自从世卫组织1980年宣布消灭天花后，大多数国家终止了常规的天花疫苗接种，导致全球范围内相当一部分人群对猴痘病毒缺乏免疫力。此外，在接种天花疫苗的人群中，其保护作用也会随着时间的推移而缓慢衰减，从而增加了感染猴痘病毒的风险。
鉴于国内的猴痘疫情和快速增加的猴痘病例，需要在发病早期快速甄别出阳性病例，并指导后续的防治策略和疫情防控。猴痘病毒的检测可通过病毒培养和分离鉴定、电子显微镜、聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光检测等技术方法进行。猴痘病毒培养和分离鉴定为确证试验，但猴痘的培养只能在生物安全III级实验室由受过相关安全程序培训的具有相应准入资质、并具有丰富病毒分离培养经验的人员进行，但病毒分离阳性率低，需耗时数天。不建议将病毒分离作为常规检测和诊断程序。电子显微镜可用于评估样本中潜在的猴痘病毒。但电子显微镜需要专门的专业技术人员，技术要求较高，且对样本中病毒颗粒的浓度要求较高。
因此，由于所需的高技术技能和设施，这种方法并不常规用于猴痘病毒的检测。其他检测方法，如血清中和试验、凝胶沉淀、免疫荧光试验等，虽然也具有一定的诊断价值，但操作复杂，耗时长，不适合作为猴痘病毒的常规实验室检测。
目前，聚合酶链反应（PCR）检测是首选的猴痘检测方法，其中实时PCR（qPCR）技术是猴痘病毒检测和分型最有效的方法。该方法的优点是灵敏度高、通量大。但目前针对猴痘的PCR检测试剂存在检测时间长、稳定性差、操作繁琐、与其它正痘病毒存在交叉反应的风险等缺陷。而且，猴痘病毒感染潜伏期较长，实时荧光定量PCR分子诊断方法对样品采集、实验操作人员及配套检测设备有较高要求，无法保证快速鉴别感染者。目前没有可以广泛使用的商业 PCR检测试剂盒。因此，针对猴痘病毒有效的快速、灵敏、精准的检测方法亟需建立。
2023年10月16日，中国医学科学院病原生物学研究所郭斐课题组在Cell Reports Methods期刊发表了题为：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究论文。
该研究建立了一种快速精准的猴痘病毒检测方法，通过将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，可以实现猴痘病毒DNA在30分钟内的快速检测，检测灵敏度1个拷贝数，同时能够精准区分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的实用价值。
研究团队首先设计了两个crRNA的检测体系池，其中一组靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守区D6R和E9L，可以检测所有的正痘病毒；另外一组靶向猴痘病毒特有的区域N3R和N4R。通过对crRNA的设计和筛选，建立了基于CRISPR/Cas12a的荧光报告体系（图1）。
图1：CRISPR-Cas12a检测体系的建立及crRNA的筛选
进一步针对选择的crRNA，分别检测不同拷贝数的质粒模板以及病毒DNA模板，观察到CRISPR-Cas12a单独检测体系的检测限约为108拷贝数，不同crRNA的联合可以将检测限提高到107拷贝数，同时实现了正痘病毒与猴痘病毒的区分。并且为了实现最低检测限，研究团队团队将等温扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，最终能够达到1个拷贝的最低检测限，大大提高了检测体系的灵敏度（图2）。
图2：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的实现1个拷贝的最低检测限
为了验证检测体系实际应用的可靠性与准确性，针对中国大陆第一例猴痘病例的拭子样本进行了检测。该体系同样实现了1个拷贝数的最低检测限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中检测到了猴痘病毒的DNA，证实了体系应用的可靠性。同时针对猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品的检测，阴性参考品中未检测到猴痘病毒的DNA，进一步证实了检测体系的准确性（图3）。
图3：RPA联合CRISPR/Cas12a检测体系对临床样本的检测
最终为了提高检测效率，进一步优化反应体系到单管中，大大的缩短了检测时间以及操作步骤。在提取得到待测DNA后，15分钟到30分钟内即可实现样本的快速检测，且灵敏度高达1个拷贝数。相比于传统荧光PCR的2小时，大大缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度（图4）。
图4：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的优化
综上所述，该研究建立了猴痘病毒的快速精准的检测方法，通过crRNA的筛选建立了一套CRISPR检测体系，并联合等温扩增实现了猴痘病毒的快速、灵敏的精准检测。为猴痘病毒的快速诊断提供了有力的技术支持。
中国医学科学院病原生物学研究所助理研究员赵斐、博士生胡亚美、范张玲，中国疾病预防控制中心黄保英为论文共同第一作者。中国医学科学院病原生物学研究所郭斐研究员、中国疾病预防控制中心谭文杰研究员和中国医学科学院病原生物学研究所许丰雯副研究员为论文共同通讯作者，感谢合作者加拿大麦吉尔大学梁臣教授、北京同仁医院房居高教授、北京医院艾斌教授的大力支持。该研究获得了中国医学科学院医学科技创新工程、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的资助。
论文链接：
https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00284-9