猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种世界范围内传播的高度传染性猪病。疫苗接种是应对PRRS的主要策略,但传统PRRSV灭活或减毒疫苗提供的保护效果并不理想。迫切需要研究PRRSV与宿主相互作用的机制,以便制定更有效的控制措施。此前的研究发现,敲除miR-10a的靶基因SRP14可以显著抑制PRRSV的复制。这项研究表明PAM的PRRSV感染会诱导宿主转录因子IRF8减少,从而导致抗病毒分子miR-10a表达上调。由于miR-10a的增加,其靶基因SRP14的蛋白翻译受到抑制,从而抑制PRRSV复制。SRP14通过与nsp2相互作用促进PRRSV基因组的合成。
文章要点:
1)IRF8负向调节miR-10a的表达
荧光素酶检测结果表明,PRRSV感染会增强miR-10a启动子的活性。通过不同长度的截短体发现在miR-10a启动子的-1.1至-1.2k碱基位置之间,存在一个重要的顺式激活元件。通过JASPAR和Gene Regulatory数据库中搜索miR-10a启动子-1.1至-1.2 k区域,找到IRF8的结合位点。删除预测的IRF8结合位点,结果显示启动子活性显著增加。进一步结果表明si-IRF8的导致miR-10a表达上升,而Flag-IRF8的表达抑制miR-10a的表达。
2)IRF8过表达促进PRRSV复制
IRF8的过表达导致miR-10a的表达下降,而PRRSV ORF7 mRNA和N蛋白的表达显著增加。滴度测定显示IRF8过表达组的子代病毒产量高于对照组。稳定表达IRF8的MARC-145细胞系,并用PRRSV GD-HD和PRRSV-mcherry感染结果证实IRF8有利于PRRSV复制。
3)过表达SRP14可促进PRRSV复制
先前的研究表明,miR-10a负向调节SRP14蛋白的活性。RT-qPCR分析表明,过表达SRP14可促进PRRSV ORF7 mRNA和N蛋白的表达。过表达SRP14大大增加了上清液中原病毒的滴度。用表达SRP14的重组慢病毒或对照慢病毒培养PAMs 24小时,然后用1 MOI的PRRSV GD-HD感染,Western blot和病毒滴度检测结果证实SRP14的过表达参与PAMs中PRRSV的复制。
4)SRP14促进PRRSV双链RNA的合成
通过RT-qPCR采集一半的细胞进行病毒吸附检测,其余细胞进行病毒进入检测,结果发现MARC-145-SRP14细胞对病毒的吸附和进入均无明显增强。SRP14的过表达显著增加了PRRSV dsRNA的水平。
图 SRP14促进了PRRSV基因组RNA的复制
5)SRP14与PRRSV nsp2相互作用
Flag-SRP14与GFP-nsp2相互作用,与GFP-nsp10相互作用较弱,但与其他病毒蛋白没有相互作用。在反向Co-IP实验中,发现GFP-SRP14与Flag-nsp2有效的相互作用。荧光共聚焦显微镜证实了SRP14和nsp2的共定位。RTCs是由PRRSV的非结构蛋白(包括nsp2/3/9/10)形成的复制和转录复合物。病毒 RTC 的关键成分nsp9也与SRP14共定位。nsp4不是PRRSV RTCs的组成成分,被用作阴性对照,没有与SRP14共定位。
图 SRP14与PRRSV的nsp2相互作用
来源:Immunity advances
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