近日，上海交通大学王鹏飞教授和团队，设计一种无需预扩增的新型 DNAzyme 传感器，并将其并命名为 SPOT。
图 | 王鹏飞（来源：王鹏飞）
对于以 miRNA 和病毒 RNA 为代表的多种临床意义核酸标记物，本次传感器均具备检测能力，并能实现快速、便捷的临床分子诊断应用。
通过针对血清 miRNA 进行敏感和特异的检测，进而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多种癌症的分子诊断。
此外，SPOT 能从临床拭子中灵敏准确地检测 SARS-CoV-2 RNA。同时，SPOT 可以与侧流层析技术联合，实现对于核酸靶标的即时（POCT，point-of-care testing）检测。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
鉴于 SPOT 完全由合成 DNA 分子构建，避免了对于昂贵蛋白质酶的需求，具备较好的成本优势。
实验显示，一次 SPOT 测定的材料成本，大约低至 0.02 美元，明显低于已有的检测体系。
与现有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶标测定相比，这种灵敏且特异的分析性能、一步法的操作方案、低成本的优势、以及和 POCT 能力的结合，让 SPOT 能够成为一种更好的测定方法。
未来在检验医学领域，该团队希望利用 SPOT 体系针对循环体内核酸进行检测，实现多类型疾病的灵敏特异分子诊断，从而为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的可能。
进一步地，他们也希望基于核酸适体的结合，能够进行小分子与蛋白的检测，扩展 SPOT 系统在多方面的临床诊断应用。
此前，在体内递送治疗方面，传统的 DNAzyme 不具备可编程的靶向性。而该团队设计的新型 DNAzyme 体系可以快速设计和实现可编程的靶向目标链，并通过切割来达到治疗目标。
总的来说，这一创新有望为疾病治疗提供更精准、更有效的手段，为基因治疗和精准医学的发展带来重要推动。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
那么，本次成果的研发必要性是什么？它弥补了已有测量工具的哪些不足？
据介绍，生物体液（血液、尿液、汗液等）中存在的核酸分子，是对包括癌症和病毒感染等重大疾病进行分子诊断的一类关键生物标志物。
然而，核酸标志物存在低丰度、高度动态、高异质性、背景干扰大等特点，其临床检测面临着测不出、测不准、测不全、测不了、测不起等挑战。
因此，迫切需要开发超灵敏、高特异、通量高、便捷经济的核酸生物标志物检测分析方法。
DNAzymes 是一类体外筛选的合成 DNA 分子，具有类似酶的催化活性，例如裂解核酸磷酸二酯键。
典型的裂解核酸 DNAzyme，由具有催化能力的催化核心、以及用于通过序列互补性识别底物的两条臂组成。
因此，当前许多 DNAzyme 已经广泛用于体外和体内的金属离子检测，因为它们的催化活性高度依赖于金属离子。
然而，具有小分子、蛋白质或核酸检测能力的 DNAzyme 鲜有报道，导致这些目标很难被检测到。
受自然酶和核酸酶的启发，通过实施异构模块（如 aptamer、toehold）来设计异构的 DNAzyme 生物传感器，可以通过小分子、蛋白质、核酸或细菌等，调节因子介导其催化活性。
传统的异构 DNAzyme 生物传感器通常被设计成多组分分子复合体，通过具有 toehold 的抑制链，来抑制并释放 DNAzyme。
以及通过在靶结合后分裂并恢复催化核心，或通过靶诱导的 DNAzyme-底物-靶标复合物的稳定，来实现对于核酸靶的直接检测。
然而，这些生物传感系统对于定向核酸的直接检测，通常表现出皮摩尔至纳摩尔的敏感性，因此无法探测临床样本中的 miRNA 或病毒 RNA 标志物。
而许多 miRNA 被视为是多种癌症的潜在生物标志物，然而由于缺乏癌症诊断的敏感性和特异性，很少有 miRNA 被证明在临床上有用。
王鹏飞认为，这种多组分设计可能会对其检测能力产生负面影响。
由于一些原因比如化学计量的不完善、动力学分子陷阱、催化活性受损、以及信号泄漏的风险增加，会导致低丰度目标更加难以被测量。
而该课题组的主要研究兴趣是：开发简单、快捷、灵敏的新型疾病分子诊断方法。
通过调研，该团队发现体液中的循环核酸已经成为多种疾病的重要液体活检生物标志物。
由于这些核酸生物标志物在生物标本中的高度动态、异质性和低丰度，导致其临床检测面临着巨大挑战。
传统的聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）技术需要严格的样品处理、昂贵仪器和专业操作。
而新型等温扩增方法，比如重组酶聚合酶扩增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）、环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated isothermal amplification）等则能简化操作过程。
而尽管 CRISPR 结合等温扩增技术，能够显示出较高的灵敏度和便捷性，但是存在非特异性扩增、连续操作步骤和对昂贵易损酶的需求等缺陷，限制了临床上的应用。
通过对以上这些因素的思考、并结合课题组自身优势，他们定下了本次课题。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
通过理论模拟与设计，他们设计出了这种新型 DNAzyme 传感器 SPOT。为了明确 SPOT 的机制并优化实验参数，课题组研究了具体的激活方式、以及可应用的核酸靶标长度。
由于 DNAzyme 传感器的自身特性，最初他们设计的 DNAzyme 传感器信号泄漏非常严重，无论如何优化实验条件，都无法达到稳定、高灵敏的检测目的。
通过大量的文献调研，以及学习和理解此前 DNAzyme 传感器的设计原理，再结合组内讨论他们认为：自封锁核酸链的设计，或许可以解决信号泄漏的问题。
后来，通过一系列的实验，信号泄漏问题已经被解决。但是，DNA 酶传感器却无法被激活。
于是，他们进一步优化参数，通过缩短结合臂的长度，最后成功构建了 DNAzyme 传感器。
通过此，他们构造了一个单链、自锁定的单分子系统，并将这种传感系统命名为 SPOT（用于核酸检测的灵敏的环启动 DNAzyme 生物传感器）。
同时，他们进一步将 SPOT 与试纸条结合，为 SPOT 实现 POCT 检测奠定了基础。
经过全面优化和 SPOT 检测，在单管、一步、无预扩增和等温检测的前提下，实现了对 miR-21 的 15fM、对病毒 RNA 的 1.9aM 的强大检测灵敏度，以及对于核酸靶标的检测特异性（区分变异体）。
最终，相关论文以《一种用于核酸敏感检测的可编程 DNAzyme》（A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids）为题发在 Angewandte Chemie International Edition[1]。
史辰致是第一作者，王鹏飞担任通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Angewandte Chemie International Edition）
不过，目前只有少量临床样本在 SPOT 上进行测试。未来，课题组将对更多患者进行临床研究，以便全面评估 SPOT 测定的可靠性。
同时，由于本次研究采用了无前置放大器的方案，因此 SPOT 还不够灵敏，无法在肉眼可见的测试条上，产生明显可区分的读数。
因此，该团队打算进一步提高 SPOT 的灵敏度，或与基于等离子体/荧光的便携式可视化设备结合，以便让 SPOT 的 POCT 能力能被用于实际应用。
未来，在临床应用层面，他们希望能够建立多中心、大规模临床队列，对 SPOT 体系的疾病诊断效能进行更大范围的论证。
在技术改进层面，该团队计划拓展 SPOT 的应用范围。除了核酸检测外，他们也希望通过引入核酸适体，来实现对于小分子和蛋白标志物的检测。
参考资料：
1.Shi, C., Yang, D., Ma, X., Pan, L., Shao, Y., Arya, G., ... & Wang, P. (2024). A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids. Angewandte Chemie International Edition, e202320179.
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