编者按：碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）已成为院内感染的重要难题，其耐药性不断升级，引发全球关注。在第34届欧洲临床微生物学与感染病学大会（ESCMID Global 2024）中，浙江大学医学院附属邵逸夫医院俞云松教授团队的一项研究（摘要号：P1673）展示了关于CRKP基因组流行病学和耐药机制方面的最新成果。研究结果表明，ST20 CRKP携带多种耐药基因，其中碳青霉烯金属酶对新型酶抑制剂复合制剂的有效性构成威胁，这一发现对于临床抗感染治疗和抗菌药物管理策略的制定具有重要意义。
染色体整合和质粒融合诱导同时携带blaNDM-1和blaIMP-4的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）菌株在传播、耐药性和适应性方面的差异（摘要号：P1673）
目的
明确新发CRKP克隆（ST20）在中国的流行情况，并对其中同时携带IMP-4与NDM-1的菌株进行质粒分析，以确定不同质粒对传播性、耐药性及适应性的影响。
方法
在全国范围内收集到7株CRKP进行了临床常用抗菌药物敏感性测定。对7株CRKP进行了全基因组测序，分析其耐药基因与毒力基因，明确其亲缘关系；对碳青霉烯耐药基因进行S1-PFGE与Southern印迹，以明确耐药基因的质粒定位。对同时携带两种碳青霉烯耐药基因的菌株，进行接合实验，明确耐药质粒的水平转移能力；通过三代测序、质粒序列比对与反向PCR，明确耐药质粒的整合方式。最后，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，对耐药质粒进行逐个消除，并通过生长曲线与药敏测定，明确不同质粒对耐药性与适应性的影响。
结果
在7株ST20 CRKP菌株中，有4株同时携带IMP-4与NDM-1，通过基因定位实验，发现IMP-4与NDM-1存在三种不同的组合：IMP-4与NDM-1分别位于不同质粒上；IMP-4与NDM-1位于同一质粒上；IMP-4位于染色体上，NDM-1位于质粒上。其中携带NDM-1耐药基因的质粒可以水平转移，而IMP-4耐药基因无法通过自身进行水平转移。
△（A）7株ST20菌株的系统发育树；（B）S1核酸酶消化质粒模式和Southern印迹。
质粒比对发现IMP-4质粒通过IS26整合至NDM-1质粒上，形成融合质粒；而IMP-4质粒通过ltrA重组至细菌染色体上，形成染色体“固化”的耐药性；而这两种耐药质粒的整合形式均与转座单元（TU）相关。
△（A）CHN03027、CHN13011和CHN13105的基因组比较；（B-C）环形转座单元形成示意图。
通过质粒消除，获得仅携带单个耐药质粒以及染色体携带IMP-4的菌株。但在消除融合质粒时，经过多次尝试，仅消除部分携带NDM-1的质粒片段，并且消除株质粒大小不一。通过PCR验证，发现这种现象是由于IS26间发生重组导致的。
△（A）S1核酸酶消化的质粒和相应的质粒消除菌株；（B）IS26在CHN13105-ΔNDM中重组差异示意图。
耐药质粒全部消除后，细菌呈全敏感，仅携带IMP-4耐药质粒的菌株耐药性要低于仅携带NDM-1耐药质粒的菌株，其差异至少可达8倍。耐药质粒消除后，并不影响细菌在普通培养基中的生长速度，但仅携带IMP-4耐药质粒的菌株在含有2 mg/L美罗培南的培养基中，生长的迟滞时间大大延长，表现为适应性下降。
△携带两种碳青霉烯酶的原始菌株及其质粒消除后菌株的敏感性
△（A-B）在MH肉汤或含有2 mg/L美罗培南的MH肉汤中的生长曲线；（C）野生型菌株与相应质粒消除菌株的滞后时间比较。
结论
本研究发现IMP-4为细菌提供了基础耐药性，NDM-1提供了主要的耐药性、适应性与传播性；但IMP-4质粒存在多种形式的整合，可能作为耐药基因转移的载体。ST20 CRKP是一种新的耐药高危克隆，其同时携带多种耐药基因，尤其是碳青霉烯金属酶，会导致新型酶抑制剂复合制剂（头孢他啶-阿维巴坦）的失效，应当引起重视。
▌参考文献
[1] Shi Q, Hu H, Yu Q, et al. Chromosomal integration and plasmid fusion occurring in ST20 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates coharboring blaNDM-1 and blaIMP-4 induce resistance transmission and fitness variation. Emerg Microbes Infect. 2024;13(1):2339942. doi:10.1080/22221751.2024.2339942
[2] Qiucheng Shi, WeiyiHuang, YinpingWang, et al. Chromosomal integration and plasmid fusion induce the transmission, resistance, fitness differences in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates co-harboring blaNDM-1 and blaIMP-4. ESCMID Global 2024; Poster P1673.
俞云松 教授
感染病学教授、主任医师
浙江省人民医院副院长
浙江大学求是特聘医师
浙江省卫健委领军人才
中国医药教育协会感染疾病专业委员会主任委员；
中华医学会细菌感染与耐药防治专业委员会副主任委员；
浙江医学会细菌感染和耐药防治专业委员会主任委员
国家卫健委抗菌药物合理应用和耐药评价专业委员会副主任委员
浙江省微生物技术与生物信息研究重点实验室主任；
中华预防医学会医院感染控制委员会常务委员；
中华医学会感染病学分会常务委员；
浙江省预防医学会医院感染控制专业委员会主任委员；
浙江省医学会感染病专业委员会副主任委员；
以第一作者和通讯作者发表SCI收录论文145篇；
先后主持国家自然科学基金7项(重点项目2项)。
史秋橙 博士
医学博士
浙江大学医学院在站博士后
从事肺炎克雷伯菌耐药与毒力机制等相关研究，以第一作者（含共一）发表SCI论文16篇，主持国家自然科学基金青年项目一项。