酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期过度酗酒引起的肝脏损伤，初期常表现为酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）、酒精性肝炎，进而可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭。与啮齿类动物相比，斑马鱼具有饲养经济、方便，容易获得足够的样本量，胚胎透明、便于显微镜下观察肝脏，有利于高通量药物筛选等独特优点。与此同时，斑马鱼体内拥有代谢酒精所需的关键酶，胚胎发育第4天肝脏便开始成熟，在低剂量乙醇下暴露4周可诱导形成典型的乙醇性肝病，该模型具有病理和基因表达模式。本研究利用斑马鱼模型探讨还原性谷胱甘肽片对AFLD的保肝功效，为合理指导临床用药提供参考。斑马鱼应用于酒精性脂肪肝疾病研究是一种非常有吸引力的脊椎动物模型，它具有代谢乙醇途径，而且相比较于其它动物模型，斑马鱼具有以下几个优点：（1）给药方便，酒精能够非常方便添加进饲养鱼水，一定程度上模拟了人酗酒状态，而其他动物模型通常采用灌胃模型，操作复杂而且技术性较强；（2）相比其它动物模型，实验花费时间少，费用低；（3）实验相关生理生化指标和病理生化指标也是较易评估，对实验可行性奠定了基础。

实验流程

斑马鱼于28℃恒温环境中，自动计时器控制实验室光照14h，黑暗10h，每日定时定量投放鱼饵料，连续一个星期，实验待用。斑马鱼发育至3月龄达到性成熟，可用于交配。取卵前一天，成鱼喂食晚餐30min后，以雌雄1:1或2:1的比例置于同一鱼缸中，用挡板将雌鱼与雄鱼分开。次日早晨拔去挡板，雌雄鱼交配产卵，每隔15-20分钟收集一次鱼卵，1h内收集完。标记收集时间，用虹吸管吸走皿中死卵及杂质，再置于28.5°Ｃ恒温生化培养箱中孵育。每天观察鱼卵发育情况，剔除死卵及杂质。斑马鱼发育至5dpf可移出培养箱，置于小缸中饲养。

为筛选最佳的酒精饲养浓度，将随机取75只斑马鱼用于酒精浓度的选择，设定四个酒精浓度条件组：1%、1.5%、2.0%、2.5%进行预实验，以Holfreter水（0.05g/L KCl、0.1g/LCaCl2、0.025g/LNaHCO3、3.5g/LNaCl PH=7.0）饲养作为对照组，每组15只。确定最佳浓度后，取300只随机分为2组，一组为正常对照组，另一组为实验组，每组150只。正常对照组采用Holfreter水饲养。模型组采用酒精溶于Holfreter水，致其终浓度为1.0%。正常对照组，实验组分别用加热棒保持水温28℃，每天一换水，每日定时定量喂给新鲜的丰年虫，连续四周。

动物取样

各组斑马鱼末次换水后，实验动物禁食12h。斑马鱼处死前称体重，自眼球采血，每50只为一组，空白对照组，实验组各3组，采血后即刻处死，称重，快速分离实验所需肝脏组织，将肝脏组织称重，然后甲醛固定或液氮保存。观察并记录斑马鱼畸形、死亡率等情况，收集样品。

乙醇对斑马鱼生存率及表形的影响

酒精对成年斑马鱼存活率的影响呈浓度和时间依赖性，成年斑马鱼暴露于酒精浓度范围1.0%-2.5%7d，与正常对照组相比，酒精浓度高于1.0%在实验过程中陆续出现死亡，特别是2.5%酒精浓度中的斑马鱼快速死亡，而斑马鱼暴露于1.0%的酒精却能够存活。通过对实验进行观察和数据统计，对数据进行处理分析，得出酒精对斑马鱼成鱼半致死浓度LD50=1.3%,而1.0%酒精浓度是其可耐受浓度。与对照组相比，酒精处理组斑马鱼造成的形态和行为都发生了异常，可以观察到酒精组斑马鱼食物摄入减少，皮肤表面变暗以及腹部稍白。还可以观察到酒精处理过后斑马鱼嗜睡，游动速度减缓以及路线不定向等。对照组斑马鱼解剖后肝脏较模型组鲜红。模型组斑马鱼肝细胞结构破坏严重，肿胀明显，呈现空泡形状，肝板排列紊乱，大泡性脂肪变性，小叶炎性浸润。

往期推荐

参考文献：

1、葛炜炜,曹刚,吴育,等.还原型谷胱甘肽对酒精性脂肪肝斑马鱼的保肝作用研究[J].药物评价研究,2021,44(08):1594-1599.

2、Passeri M J, Cinaroglu A, Gao C, et al. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation [J]. Hepatology, 2009, 49(2): 443-452.

3、赖裕玲. 虎杖苷对斑马鱼幼鱼酒精性脂肪肝的治疗作用及机制研究[D].南方医科大学,2019.

4、Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.[J]. Sapp Valerie;;Gaffney Leah;;EauClaire Steven F;;Matthews Randolph P.Hepatology (Baltimore, Md.),2014

找实验方法，上脑声常谈

斑马鱼行为篇㉞：斑马鱼酒精肝模型