EASL大咖访谈丨鲁凤民教授：从机制研究到临床治愈——探寻CHB潜在治疗策略

在慢性HBV感染领域，关于基础核心启动子（BCP）和前C蛋白（PC）突变的发现已近三十年。然而，这些突变与慢性乙型肝炎（CHB）疾病进展的潜在联系，以及它们是否影响抗病毒治疗的应答，一直是病毒学家们长期研究的焦点。在2024年欧洲肝脏研究学会（EASL）年会上，北京大学感染病研究中心的鲁凤民教授分享了其团队的两项最新研究成果。首先，他们揭示了BCP+PC突变病毒感染对肝细胞的影响，指出这种突变病毒能诱导更广泛、严重的肝细胞变性和胞质空泡化，并抑制人肝细胞的内源IFN-α/γ信号通路。这一发现可能为部分患者干扰素治疗应答不佳提供了新的解释。此外，鲁凤民教授对整合型HBV DNA中HBsAg的表达调控与分泌机制进行了深入研究，并基于这一发现提出了CHB治疗的新策略。本刊特邀请鲁凤民教授进行了深度访谈，以下是对访谈内容的整理，以供读者参考。

鲁凤民教授：人们对HBV编码HBeAg前体的前C蛋白（PC）终止密码子突变和核心启动子区（BCP）突变的关注，始于20 世纪90年代以色列一家医院由于医源性传播导致的急性乙型肝炎暴发事件，该事件导致了数名患者死亡。美国NIH的Jack Liang教授牵头做了病原学分析和溯源，找到了其传染源是一位携带了PC突变的CHB患者带来的交叉污染。几乎同时，日本学者Omata教授也报告了在日本的急性重肝如暴发性乙型肝炎相关肝衰竭患者检测到了PC突变。这些研究发现将该突变与重型肝炎联系在一起。

由于PC突变多发生在BCP突变的基础上，后者也受到了应有的注意。后期的流行病学研究显示，该两突变均不利于暴露后慢性感染的建立。所以我们看到，尽管随着慢性感染的持续和疾病的进展，携带这些突变的变异株所占比例逐年增加，并成为优势病毒株，但无论是母婴垂直传播还是成人间的性传播，慢性感染的建立均以野生型HBV为主。

一项近期的多中心、多种族、多基因型慢性HBV感染人群的突变研究显示，约18.4%的患者体内主要（占比大于50%）的HBV病毒株是携带了PC突变的病毒变异株，24.2%的患者携带的主要病毒株为BCP突变株，另外还有11.0%的患者的主要病毒变异株为同时携带了PC及BCP突变，只有46.3%的患者以野生株感染为主。而随着HBeAg消失和（或）血清学转换，慢性感染患者体内突变株为优势病毒株的比例高达71.1%；同样地，随着年龄增长，患者体内突变株的比例显著增加，年龄大于40岁的HBeAg阳性和阴性患者中，该比例分别为55.8%和75.2%。这提示上述突变可能在慢性感染的维持中发挥了作用。

与之一致，我们近期的Meta分析显示，PC突变在HBeAg阴性慢性HBV感染者中与较高的血清HBV DNA水平相关，而这在HBeAg阳性患者中则相反。进一步的分层分析发现，PC突变与慢性肝炎相关，表明其可能通过加重肝损伤促进疾病进展。Meta分析的结果的确显示PC突变与肝硬化和HCC发生显著相关，而抗病毒治疗可降低PC突变相关的肝硬化风险。并且，PC突变的这种致病性在不同基因型间可能无明显差异。

鲁凤民教授：本研究所用的实验小鼠是通过将人原代肝细胞移植到免疫缺陷小鼠肝脏内的人肝细胞嵌合小鼠，是人肝细胞、鼠肝细胞残余共存的状态。通常认为肝损伤是由HBV特异性免疫清除感染肝细胞所致，但我们对免疫缺陷的人肝嵌合小鼠肝组织进行H&E染色，发现相较于WT病毒，BCP+PC突变病毒感染可诱导更为广泛、严重的肝细胞变性和胞质空泡化，表明PC联合BCP突变病毒感染可诱导人肝嵌合小鼠更严重的人肝细胞损伤。

对感染野生和突变病毒株的人肝细胞的测序结果做差异表达谱及聚类和功能分析发现，感染BCP+PC突变株小鼠的人肝细胞中内质网应激（ERS）和TNF信号通路被激活。通过RT-qPCR和8-OHdG组织化学染色，我们发现BCP+PC组小鼠肝组织中嵌合的HBV感染的人肝细胞的GRP78、XBP1、ATF4、CHOP、GADD34、ERO1A和ERO1B的mRNA水平显著升高，且BCP+PC组小鼠肝组织中存在8-OHdG染色阳性细胞，而WT组则很少检测到，证实了突变株引起了更强的人肝细胞ERS的发生和ROS的形成。此外，富集分析还显示，BCP和PC突变共同抑制了人肝细胞的内源IFNα/γ信号通路，据此我们推测，这可能是BCP和PC突变的cccDNA对IFNα治疗应答不佳的原因。

介导HBV感染的肝细胞膜受体NTCP在人、鼠间存在的差异使得小鼠肝细胞不为人HBV所感染。上述感染了BCP+PC突变病毒小鼠的人肝细胞大量损伤、死亡现象，让我们预期嵌合小鼠肝组织中残余的小鼠肝细胞将会代偿性增殖。与之一致，以小鼠基因组为参考对测序结果的分析证实，感染BCP+PC突变病毒株的小鼠肝组织中细胞周期和Hippo信号通路显著激活，表明人肝细胞损伤诱导了小鼠肝细胞的代偿性增殖。

鲁凤民教授：突变病毒在维持cccDNA池方面具有更强的能力。这一推测一定程度上与既往的临床研究发现相契合：相比于基线时HBeAg阳性的患者，HBeAg阴性患者在使用核苷（酸）类似物（NA）治疗后HBV DNA能更快降至灵敏试剂的检测限以下，但停药后往往更容易发生病毒学反弹。除此之外，我们甚至可以预期，与自然发生HBeAg阴转、突变株占主导的HBeAg阴性患者相比，NAs治疗的HBeAg阴转患者（以野生株为主体）的治疗效果可能更佳、更易于实现临床治愈。这也提示我们应该对患者尽早启动抗病毒治疗，以减少可能的突变发生和累积，并延缓疾病进展。

需要强调的是，PC/BCP突变病毒对IFN治疗的应答不佳已有一些研究报道，但PC/BCP突变是否会影响NA治疗的疗效，是否可以用于指导抗病毒治疗仍需进一步的临床观察研究，这在NA治疗为主的当下，开展起来并不难，有心做就行。此外，未来还可以进行HBV突变检测指导下的免疫治疗的前瞻性队列研究，以评估突变病毒的持续感染对肝癌免疫治疗的影响。

综上，从临床实践的角度我们认为，检测PC突变具有预测疾病进展和抗病毒治疗应答的潜力，未来有可能用于指导慢性HBV感染者的临床管理，特别是在HBV B或C基因型流行的东亚和东南亚地区。

鲁凤民教授：CHB的“功能性治愈”仍然是一个巨大的挑战。其中一个重要的原因是HBV DNA的整合，它限制了功能性治愈的实现。为了揭示整合型HBV DNA中HBsAg的独特特性，并为实现功能性治愈提供新的思考，我们团队在对临床队列进行分层分析的基础上，进一步利用动物和细胞模型，模拟了整合型HBV DNA的表达和分泌特点、探究了其潜在机制。

通过对563名未经治疗患者的肝内HBsAg蛋白水平的半定量分析，结果发现，与HBeAg阳性患者相比，尽管HBeAg阴性患者的血清HBsAg水平显著降低，但其肝组织内的HBsAg蛋白水平并没有显著降低。进一步的研究表明，这可能是由于整合型HBV DNA中2.4 kb HBV RNA的比例相对增加，导致大表面抗原（L-HBsAg）过度表达，进而影响了HBsAg的分泌效率。

进一步的机制分析显示，这一变化是由于整合HBV DNA的核心启动子缺失。导致了增强子1（EnhI）以缺失再扫描的机制重新定向于preS1（SP1）启动子。这种对SP1和SP2启动子的不均匀激活，导致了L-HBsAg的过表达和细胞内滞留，进而影响了HBsAg的分泌。

鲁凤民教授：整合型HBV DNA中HBsAg的表达和分泌与血清中HBsAg水平的关系不完全一致，揭示了在追求CHB的治愈上，除了共价闭合环状DNA（cccDNA）外，整合型HBV DNA的表达与分泌更是CHB难以治愈的关键因素。

基于这一发现，我们也提出了未来CHB治疗的新策略。首先，需要反复强调治疗时机的重要性，以为未来的慢性乙肝治愈做准备。例如，应建议在免疫耐受状态下开始抗病毒治疗，以阻止整合的发生；并通过抑制病毒复制，来预防和减缓肝脏炎症带来的死亡，阻止携带整合HBV DNA的肝细胞通过代偿性增殖形成克隆性细胞集落并持续活跃表达HBsAg，为未来的临床治愈铺路。其次，RNA干扰治疗是目前已知的能够有效抑制整合型HBV DNA表达HBsAg 的治疗策略，适当延长治疗以持续减少HBsAg的表达可能有助于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能恢复。这种治疗方法可能会为CHB的治愈带来新的希望。

总而言之，该项研究揭示了整合型HBV DNA中HBsAg的表达与分泌机制，及其对CHB治疗策略的潜在影响。这一发现不仅为我们理解CHB的发病机制提供了新的视角，也为未来CHB的治疗提供了新的思路。随着对整合型HBV DNA的深入研究和新型治疗方法的开发，我们有理由相信，CHB的治愈将不再是一个遥不可及的梦想。