编译：Guannan

【Nature】Sleep loss diminishes hippocampal reactivation and replay

睡眠过程中海马的场电位（Sharp-wave ripples）与spike放电模式

背景

记忆在学习后会经历一个持续的精细化过程，这一过程被称为记忆巩固，而睡眠在其中发挥着关键作用。研究表明，学习后立即进行的睡眠有助于巩固记忆，而即使是短暂的睡眠缺失也可能破坏记忆。海马在依赖睡眠的记忆巩固过程中具有重要作用，但睡眠缺失如何具体影响记忆的机制尚未完全理解。

海马的尖波-波纹（Sharp-wave ripples, SWRs）被认为是其中的关键机制。SWRs的特征是在CA1锥体细胞树突中产生尖波，同时在细胞体附近伴随150-250 Hz的波纹振荡。SWRs广泛被认为在依赖睡眠的记忆处理过程中起着重要作用。研究发现，在完成记忆任务后，睡眠中的SWRs出现频率增加。如果在这些振荡期间干扰活动，会损害记忆，而增强它们则有助于记忆的改善。

SWRs的一个关键特征是它们在海马CA3区域生成，并在整个海马结构及更远的脑区引发强烈的尖峰活动。这种同步化活动推动了与个体记忆相关的网络连接中的突触可塑性，增强了记忆的储存和回忆。实际上，SWRs不仅与通过长期增强（long-term potentiation, LTP）实现的突触加强有关，也与通过长期抑制（long-term depression, LTD）导致的突触减弱有关。

特别是，SWRs期间的尖峰活动可以高度模式化，以时间压缩的方式重新激活并重现最初在学习和行为中形成的活动模式，这类似于快速复习。通过这种复习，SWRs可以强化并稳定海马中的空间表征，并将这一信号传递至皮层和皮层下脑区。尽管SWRs期间的再激活和重现被广泛认为在记忆巩固过程中起到关键作用，但关于这些事件如何受到睡眠剥夺（sleep deprivation, SD）影响的情况仍然未知。

要点

1. 在睡眠剥夺（SD）期间，尽管尖波波纹（SWRs）的发生率保持较高，但其功率较低、频率较高，这与自然睡眠状态有所不同。

2. 尽管SD期间SWRs的发生率较高，神经元活动模式的再激活和重现却显著减弱，甚至消失。

3. 恢复睡眠后，再激活部分恢复，但未达到自然睡眠水平。

4. 这些结果表明，SWRs的丰富性与神经元活动的再激活和重现之间存在脱节，凸显了睡眠剥夺对海马功能的负面影响。

5. 进一步分析发现，SD期间delta波的增加与再激活的减弱显著负相关，表明睡眠压力水平可能影响海马再激活。

6. 然而，SD期间再激活的个体差异无法完全由运动活动、觉醒状态或delta波的差异来解释。

综上所述，本研究揭示了睡眠剥夺对海马再激活和重现的不利影响，为理解睡眠在记忆巩固中的机制提供了新的见解。

预备知识

Sharp-wave ripples (SWRs)：是海马区域中观察到的一种重要的神经活动模式，由两个主要成分组成：

• Sharp waves: 这是在海马CA1区域树突层（stratum radiatum）中观察到的一个大振幅负波形信号。这些尖波反映了来自CA3区域的同步兴奋性输入，汇聚到CA1神经元的树突上。

• Ripples: 这是一种高频（约150-200 Hz）的振荡信号，主要出现在CA1区域的锥体层（pyramidal layer）。这些波纹与尖波同步发生，反映了CA1区域神经元之间的同步放电。

Zeitgeber time (ZT，时间同步因子时间)：是一个术语，通常用于生物钟研究中，用来描述生物体在昼夜周期内的活动状态。Zeitgeber是德语词汇，意为“时间给予者”，通常指影响生物钟同步的外部环境因素，如光暗周期、温度变化等。

在实验中，Zeitgeber time通常以ZT0和ZT12表示昼夜周期的起始点。比如：

• ZT0 通常代表灯光开启的时刻（即生物昼周期的开始）。

• ZT12 通常代表灯光关闭的时刻（即生物夜周期的开始）。

这个概念有助于标准化实验条件，使得不同实验室的实验结果可以更好地比较和解释。

再激活（Reactivation）：指的是在特定的脑电活动（如SWR事件）期间，海马神经元在睡眠期间会重复激活之前在新环境中形成的活动模式的过程。这一过程被认为有助于记忆巩固，特别是在睡眠过程中。

重现（Replay）：指的是海马神经元的活动以时间压缩的方式重现之前在新环境中形成的时间序列活动模式，这一过程被认为在记忆巩固和学习中起到重要作用。

轨迹重现（Trajectory replays）：指的是在动物睡眠或休息期间，海马神经元活动模式能够重现动物之前在迷宫中运动的轨迹。研究人员使用多单元神经元活动（multi-unit activity, MUA）检测与SWR同时发生的神经元群体爆发事件，并采用贝叶斯解码方法计算动物在每个位置bin上的概率，得到“解码位置”。如果一个候选SWR事件在60毫秒或更长时间内解码出连续的轨迹，且相邻时间bin间的解码位置距离小于40厘米，则被归类为“轨迹重现”。

这种轨迹重现现象在动物自然睡眠（non-sleep deprivation, NSD）期间最为常见，但在睡眠剥夺（SD）和恢复睡眠（recovery sleep, RS）期间会显著减少。具体来说，SD期间轨迹重现的比例和总频率都显著降低，即使在RS期间也无法完全恢复到NSD水平。这表明睡眠对记忆巩固和空间记忆的重现过程至关重要。

总之，轨迹重现是一种神经活动模式，能够在动物睡眠或休息期间重现其之前在迷宫中运动的轨迹，这一过程受睡眠状态的影响。

01

长时间海马CA1神经电生理记录：涵盖行为、睡眠与睡眠剥夺

研究人员进行了长时间的海马CA1区域神经电生理记录，涵盖了行为、睡眠和睡眠剥夺期间的不同阶段。他们使用128通道高密度硅探针对大鼠进行了单侧和双侧植入记录，记录过程中跟踪了局部场电位（local field potential, LFP）和稳定的神经元活动，共包括754个锥体神经元和96个抑制性神经元。

实验记录分为以下几个阶段：1）在光照周期开始前约3.5小时进行2.5小时的基线睡眠和休息（PRE）；2）将动物置于之前未探索过的线性迷宫环境中，允许其自由活动约1小时（MAZE）；3）动物返回家笼后分为两组，一组进行正常睡眠（NSD），另一组进行5小时的睡眠剥夺（SD），随后进行恢复睡眠（RS）。

功率谱分析显示，在非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement, NREM）期间，海马LFP呈现出强烈的δ波（低于4 Hz），而在快速眼动睡眠（rapid eye movement, REM）期间则以强烈的θ波（5-10 Hz）为主。在睡眠剥夺期间，虽然整体δ波减少，但孤立的δ波出现率增加，暗示可能存在微睡眠或局部睡眠的现象。总体而言，睡眠剥夺期间各频段的功率均较低，而在恢复睡眠期间，δ波出现强烈反弹，符合睡眠恢复的特征。

图1. 睡眠剥夺期间出现更多但功率较低、频率较高的ripples

a. 在PRE阶段后，动物被引入迷宫（MAZE），然后分别经历了不受干扰的睡眠（NS1-NS2）或5小时的睡眠剥夺（SD1-SD2），随后进入恢复睡眠（RS）。
b. 在NSD（左）和SD（右）阶段的样本中，比较了功率谱密度与不同脑状态（包括活跃清醒（AW）、安静清醒（QW）、快速眼动睡眠（REM）和非快速眼动睡眠（NREM））的睡眠图（顶部）以及CA1区细胞的局部场电位（LFP）频谱图（底部；在所示时间段内对所有频率进行了标准化得分）。
c. 所有NSD阶段（黑线，灰色阴影表示标准误差；n = 8个来自7只动物的实验阶段）和SD/RS阶段（红线或蓝线，相应的阴影表示标准误差；n = 8个来自7只动物的实验阶段）的平均功率谱密度。
d. 在SD期间，δ波的发生率低于睡眠期，但从SD1到SD2，以及在RS期间有所增加（各实验阶段的数据通过连接点表示）。
e. 样本睡眠阶段（左）显示了高自发率的SWRs（sharp-wave ripples）和LFP信号（两个电极阵列的黑色信号）以及单位点图（任意颜色和排序）。尽管在睡眠期SWRs的发生率（右）有所下降，但在SD期间仍保持较高水平。
f. 图中展示了各阶段的ripples频段功率谱密度及ripples频率的移动平均（黑色）。不同时间点的样本SWRs（16通道信号，白色）通过箭头标识。
箱线图显示了使用HB估计的总体中位数和上下四分位数（须线表示1.5倍的四分位距）的比较，结果表明SD阶段的ripples频率（n = 157,964次ripples，总计8个实验阶段）高于NSD阶段（n = 143,681次ripples，总计8个实验阶段），并在RS阶段有所回升。各实验阶段的均值通过连接点表示。最右侧面板重点展示了各组的第一个睡眠阶段（NS1对比RS）与SD的第二阶段对比NSD跨组的比较。
h,i图为g图的相同分析，分别针对尖波幅度（h）和ripples频段功率（i）。

02

睡眠剥夺期间海马CA1区域SWR发生率维持高水平并在后期显著增加

在自然睡眠期间，海马CA1区域的SWR发生率随时间逐渐下降，这与睡眠的稳态调节机制相符。然而，在睡眠剥夺期间，SWR发生率始终维持在较高水平，且在睡眠剥夺的第二个时间段（ZT 2.5-5小时）甚至高于正常睡眠组。

这表明，在长时间觉醒状态下，海马CA1区域的SWR发生率不会像正常睡眠时那样下降，而是维持在较高水平。

03

睡眠剥夺引发海马CA1区域SWR的生理特性变化

睡眠剥夺会导致海马CA1区域SWR的生理特性发生以下变化：SWR的峰值频率在自然睡眠中会降低，但在睡眠剥夺期间保持较高水平，表明神经元活动的代谢水平升高。尖波振幅在睡眠后期和睡眠剥夺后期有所增加，但在睡眠剥夺期间增幅较小，可能因神经元与抑制性神经元之间的相互作用受疲劳影响。

SWR的功率在自然睡眠中逐渐降低，而在睡眠剥夺期间呈现先升后降的趋势，并在恢复睡眠后进一步增强，与尖波振幅的变化一致，提示振幅变化可能是功率变化的主要因素。总之，尽管睡眠剥夺期间SWR的总数量未减少，其频率、振幅和功率等生理特性发生了显著变化。

04

睡眠剥夺扰乱海马神经元放电动力学，维持高放电率并引发不同神经元间的竞争性放电率变化

在自然睡眠中，锥体细胞和抑制性神经元的放电率会迅速下降并维持在较低水平，而在睡眠剥夺期间，这两类神经元的放电率则维持在较高水平。睡眠剥夺期间，锥体细胞的放电率分布呈现负偏态，表明少数细胞的放电率升高而其他细胞则降低，可能反映了抑制性神经元介导的神经元间竞争。

此外，在快速眼动睡眠期间，抑制性神经元的放电率相比自然睡眠显著降低，可能表明睡眠剥夺对特定类型抑制性神经元产生了差异性影响。这些变化表明，睡眠剥夺会对海马网络活动产生显著的影响，导致放电率的异常维持和竞争性变化。

图2. 睡眠剥夺(SD)会导致海马神经元的放电模式发生显著变化
图2a展示了在不受干扰睡眠（NSD）和睡眠剥夺（SD）期间，海马锥体神经元（PNs）的放电率变化。在NSD期间，PNs的放电率随着睡眠阶段的进展逐渐下降，而在SD期间则整体上升。
图2b显示了PNs在NSD期间不同睡眠阶段（PRE、MAZE、ZT 0-2.5、ZT 2.5-5和ZT 5-7.5）的放电率呈下降趋势，而在SD/恢复睡眠（RS）期间，放电率则整体升高。
图2c展示了中间神经元（INs）在NSD和SD期间的放电率变化。与PNs不同，INs在SD期间的放电率保持在较高水平，而在NSD和RS期间则呈下降趋势。
图2d显示，在SD期间，PNs的放电率分布偏离了对数正态分布，而在NSD期间则没有出现这种偏离。这表明SD会改变PNs的放电模式。
图2e揭示，在SD期间，PNs的放电率方差更大，表明放电率的分散程度更高。
图2f表明，在波纹（ripples）期间，PNs的放电率在NSD期间下降，但在SD期间保持稳定。
图2g显示，INs在波纹期间的放电率在NSD期间下降，但在SD期间维持在较高水平，直到RS期间才有所下降。

05

睡眠剥夺显著抑制海马神经元重激活与重现，影响记忆巩固

睡眠剥夺会显著抑制海马神经元活动模式的再激活和重现。在自然睡眠后，可以观察到持续数小时的神经元活动模式再激活，这与海马在记忆巩固中的作用一致。然而，在睡眠剥夺期间，这种神经元活动的再激活和重现明显减弱，甚至完全消失。

即使在恢复睡眠后，这种再激活和重现也无法完全恢复到自然睡眠水平。再激活的减弱可能与睡眠剥夺期间δ波的增加有关，δ波反映了睡眠压力的积累，表明个体对睡眠剥夺的敏感性差异可能解释了再激活能力的差异。因此，睡眠剥夺显著抑制了海马神经元活动模式的再激活和重现，这可能是睡眠剥夺对记忆巩固产生不利影响的重要机制。

图3. 睡眠剥夺(SD)会抑制海马神经元的重激活能力,这种影响即使在恢复睡眠(RS)后也难以完全恢复
图3a：展示了在不受干扰睡眠（NSD）和睡眠剥夺（SD）期间，海马神经元配对再激活（Explained Variance, EV）的结果。在NSD期间，EV表现出持续数小时的强烈再激活。然而，在SD期间，EV表现出显著的再激活抑制：有些大鼠（如N和U）几乎没有再激活，而其他大鼠（如S和V）的再激活较弱且衰减速度更快。
图3b：上部显示了在NSD和SD期间，动物处于清醒状态（WAKE）的时间比例，两者之间没有显著变化。然而，在NSD和恢复睡眠（RS）期间，非快速眼动睡眠（NREM）的时间比例存在差异，表明睡眠剥夺对睡眠结构的影响。下部显示，在清醒状态下计算的EV在NSD和SD中都呈下降趋势，但在NREM期间计算的EV在RS中明显低于NSD，这表明再激活能力在恢复睡眠期间仍然受损。
图3c：展示了从指数拟合到不同脑状态的EV曲线中获得的衰减常数。结果表明，在NSD中，NREM期间的EV衰减比清醒期间更慢，而在SD中，尽管清醒期间的EV衰减比NSD中的清醒更慢，但仍快于NSD的NREM。这表明睡眠剥夺对海马神经元再激活的抑制效应在清醒状态下更为显著。
图3d：显示了在SD期间，EV水平明显低于NSD，这表明睡眠剥夺对再激活能力产生了显著的负面影响。虽然在RS期间EV有所反弹，但其水平仍然低于NSD对应时期的水平，表明睡眠剥夺对海马再激活的影响是持久的，即使在补偿性睡眠后也难以完全恢复。

06

睡眠剥夺(SD)和恢复睡眠(RS)期间,海马神经元活动序列重现(sequence replay)会显著弱化

在自然睡眠期间，神经元活动序列的重现比例较高，并随时间逐渐减少。但在睡眠剥夺期间，这种重现序列的比例显著降低，有些动物甚至几乎没有重现序列出现。即使在恢复睡眠期间，重现序列的比例也无法完全恢复到自然睡眠水平，反而进一步下降。

此外，不仅重现序列的比例下降，其总体发生率在睡眠剥夺期间显著降低，到恢复睡眠期间仍未恢复，同时，重现序列的持续时间在睡眠剥夺期间显著缩短，并在恢复睡眠期间进一步缩短。综上所述，睡眠剥夺和恢复睡眠都会严重损害海马神经元活动序列的重现，这种损害即使在恢复睡眠后也无法完全恢复，可能是睡眠剥夺对记忆巩固产生不利影响的另一个重要机制。

图4. 睡眠剥夺(SD)和恢复睡眠(RS)对海马神经元轨迹重现(trajectory replays)的影响

图4a：展示了海马神经元的放电模式（不同颜色表示不同的神经元活动），以及原始和滤波后的局部场电位（LFP）信号。图中还叠加了归一化的轨迹位置信息，右侧灰色框内显示了一个睡眠期间轨迹重现的示例。
图4b：展示了正常睡眠（NSD）和睡眠剥夺（SD）条件下的轨迹重现示例。从图中可以看出，随着时间的推移，特别是在SD条件下，轨迹重现的持续时间显著缩短，符合重现标准的事件也逐渐减少。
图4c：显示了在SD的第二个时间段内，符合重现标准的事件数量显著减少，即使在恢复睡眠（RS）期间，这一数量仍低于NSD水平。值得注意的是，RS期间的重现事件比例显著低于自然睡眠（NS1）期间的水平。
图4d：与图4c类似，显示了重现事件的发生率。相比于NSD，SD的第一个时间段内重现事件的发生率显著下降，而在RS期间，重现事件的发生率仍低于NS1的水平。
图4e：显示了轨迹重现的持续时间变化。与NSD相比，SD的第一个时间段到第二个时间段内，重现持续时间显著缩短。在RS期间，重现持续时间进一步降低，这一趋势在NSD条件下未见明显变化。

07

总结

与自然睡眠相比，睡眠剥夺期间观察到海马CA1锥体层的尖波振幅和波纹功率较低，但波纹频率较高。较大振幅和功率通常表示CA3神经元对CA1神经元的输入同步性更强，导致CA1神经元放电更频繁，并增强整个海马系统的共振。然而，研究发现，在清醒状态下，功率较低的波纹对前额叶皮质神经元的影响更大，而振幅较低的尖波则能引发海马外区域更大的神经元响应，这表明尖波振幅大小不一定与目标区域的激活程度成正比。

睡眠剥夺期间波纹功率增加，而自然睡眠期间波纹功率降低，且频率变化趋势一致，表明这些波纹特征可以作为睡眠压力的指标。高频波纹可能反映了清醒状态下较高的代谢水平，而这种代谢水平在睡眠中逐渐降低并重置。然而，波纹频率的差异也可能反映了神经调节因子的变化，如GABA-A或5-HT受体的激活，或者CA1区域输入来源的改变。

除了波纹的生理特征差异外，还观察到与“突触稳态假说”一致的放电模式变化。该假说认为，清醒状态下神经元间连接强度增强，而睡眠则驱动突触的下调。然而，睡眠剥夺期间再激活和重现的下降速度更快，这与清醒状态在突触强化中的优势地位并不完全一致。一种可能性是，清醒状态下的突触强化并非特异于迷宫任务中的放电模式，反而可能干扰海马的再激活，促使其产生与迷宫经历不一致的新模式。

值得注意的是，尽管大多数大脑功能指标在恢复睡眠后能恢复到正常水平，但因睡眠剥夺导致的记忆损害通常无法完全恢复。这项研究强调了再激活和重现，而非仅仅波纹的发生，可能是睡眠在记忆中发挥作用及其剥夺产生负面影响的关键因素。这些神经元放电模式的紊乱可能会破坏海马的空间表征和依赖海马的空间记忆。此外，波纹为海马与其他脑区之间的通信提供了特殊的时间窗口，这种通信的受损可能对全脑网络产生广泛影响。

研究思路

研究背景

• 记忆巩固与睡眠的关系：大量研究表明，睡眠在记忆巩固过程中起到至关重要的作用，尤其是海马体内的尖波波纹（Sharp-wave ripples, SWRs）被认为在这一过程中发挥了关键作用。然而，关于睡眠剥夺对这些神经活动模式的影响，目前的研究仍然有限。

• 研究目的：本研究旨在探索睡眠剥夺对海马体神经元活动再激活和重演的影响，特别是在大鼠经历新的学习任务后，这些活动在睡眠和睡眠剥夺期间的变化情况。

研究方法

• 实验设计：研究采用高密度硅探针记录了大鼠海马CA1区域的神经活动。实验过程包括四个阶段：迷宫探索（新学习任务）、自然睡眠、睡眠剥夺以及恢复睡眠。

• 记录分析：通过记录局部场电位（Local Field Potential, LFP）和神经元放电模式，研究团队分析了尖波波纹的频率、功率以及海马体内神经元的放电模式。

所使用的技术

⦿ 神经记录技术

￮高密度硅探针：研究中使用了128通道的高密度硅探针植入大鼠海马CA1区域，以记录其在行为、自然睡眠、睡眠剥夺和恢复睡眠期间的神经活动。这些探针能够捕捉到单个神经元的放电模式以及LFP信号。

⦿ 数据处理与分析

￮信号预处理：所有记录数据首先经过预处理，去除电噪声和其他可能的伪影，然后提取出感兴趣的神经元活动和LFP信号。

￮神经元分类：通过分析峰值波形和放电频率，研究团队将记录的单位分为锥体细胞和中间神经元。

⦿ 功率谱分析

￮ LFP功率谱密度分析：通过傅里叶变换计算LFP信号的功率谱密度（Power Spectral Density, PSD），研究团队比较了自然睡眠和睡眠剥夺期间不同频段（如δ波、θ波）的功率变化，以理解不同睡眠状态下脑电活动的频谱特性。

￮尖波波纹（SWRs）分析：对记录的SWRs进行频率和功率的分析，比较了自然睡眠和睡眠剥夺期间SWRs的发生率和特征（如频率、功率和振幅）。

⦿ 时间序列分析

￮时间分段与滑动窗口分析：研究团队在大鼠的自然睡眠、睡眠剥夺和恢复睡眠期间进行时间序列分析，采用滑动窗口技术捕捉神经活动的动态变化。例如，在计算神经元再激活时，使用了15分钟的滑动窗口，以5分钟为步长进行分析，以捕捉不同时段的再激活模式。

￮部分相关解释方差（Explained Variance, EV）：用于量化迷宫探索期间神经元之间的关联模式在后续阶段的再现情况。通过计算不同时间段内神经元对之间的相关性，研究团队能够评估这些神经元活动在睡眠和睡眠剥夺期间的再激活情况。

⦿ 再激活和重演分析

￮再激活分析：使用EV指标评估在睡眠和睡眠剥夺期间，迷宫探索任务后神经元活动模式的再激活情况。EV值越高，说明神经元活动的再现性越强。

￮轨迹重演分析：通过贝叶斯解码方法，研究团队分析了在尖波波纹期间是否存在轨迹重演（即神经元活动再现先前迷宫探索时的路径）。轨迹重演的分析包括计算轨迹事件的跳跃距离（jump distance）和重演的时间长度。

⦿ 统计分析

￮ Hierarchical Bootstrap (HB)：研究中广泛使用了Hierarchical Bootstrap法对神经元放电率、SWRs特征以及轨迹重演等多级数据进行统计分析。该方法通过对数据的多层次随机抽样，评估各组间的差异，并进行置信区间和显著性检验。

￮成对t检验和方差分析：用于比较不同实验条件（如自然睡眠和睡眠剥夺）下的各类神经活动特征，评估各组数据的统计显著性差异。

⦿ 多变量分析

￮相关性分析：通过计算神经元活动与LFP信号之间的相关性，研究团队评估了不同睡眠状态下的神经元活动模式。

主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）：可能用于降维和提取神经活动的主要模式，以便更清晰地理解神经元群体活动的变化。

全澜解决方案

全澜的闭环调控解决方案能够高效实现本研究中自然状态、睡眠剥夺模型的多层次在体电生理监测（EEG、LFP、Spike），此外还能可实现长时程、无线电生理监测（EEG、LFP）拓展行为学测试范围。该方案由AR4-M多模态无线电生理遥测系统、RSC64-RS闭环刺激器和闭环调控软件平台（APIs）、多通道在体电生理监测系统、睡眠剥夺仪组成，可实时、长时间监测多模态电生理信号（包括EEG、ECG、LFP、EMG、Spike），并提供高精度的颅内电流刺激。通过这一系统，本研究中的闭环调控方案可在一套设备中全面实现。

全系统软硬件均为自主研发，具备极高的扩展性和全面的技术支持，欢迎试用。

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编译 | Guannan

排版 | 王琳莎

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