帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是发病率第二高的神经退行性疾病，其表现为脑中聚集α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）包涵体，α-Syn的聚集会导致出现在黑质（substantia nigra, SN），并导致多巴胺能神经元的死亡，这是帕金森病的典型病理特征，因此帕金森病也被称为突触核蛋白病。相较于大脑，α-Syn蛋白聚集体更容易在胃肠道中检测，因此早在2003年，Braak等人便提出假设，α-Syn蛋白的错误折叠和聚集可能始于肠神经系统（enteric nervous system, ENS），并通过迷走神经主要以自促进的方式传播到大脑的其他区域。多年来，已有越来越多的实验证据去验证该假设，但是这些实验的动物模型或多或少都存在着局限性，因此迫切需要开发一种能够精准模拟ENS中PD病例进展的小鼠模型，用以进一步研究肠脑运输和干预治疗。

图片摘要

帕金森病和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作为两种最常见的神经退行性疾病，它们通常被认为是独立发生的。然而，越来越多的证据表明，这两种疾病之间存在一定的联系。先前研究发现，哺乳动物的天冬酰胺内肽酶（asparagine endopeptidase, ASP）能切割阿尔茨海默病中的Tau蛋白和帕金森病中的α-Syn，并产生Tau N368和α-Syn N103片段，这些片段会增强蛋白质聚集，进而加剧大脑中的神经毒性。此外，Tau与α-Syn相互作用也会形成更紧密的毒性原纤维，其在AEP依赖性方式下，其传播潜力和神经毒性增强。现已发现，这两种片段均可以在PD和AD患者的肠道活检组织中检测到，存在共定位现象，但具体的传播机制仍不清楚。

为了探究这一问题，深圳理工大学叶克强团队联合中国人民解放军空军军医大学武胜昔、项捷团队通过构建一种全新的肠道帕金森病小鼠模型，这些小鼠模型能其肠神经系统ENS中表达带有红色荧光蛋白（RFP）标签的α-Syn N103、Tau N368或同时表达双片段，而在大脑中不表达。通过该小鼠模型，研究团队成功模拟了源自肠道的α-Syn和Tau共病理在大脑中的传播过程，并观察到相关的行为障碍。该项研究成果Gut-induced alpha-Synuclein and Tau propagation initiate Parkinson’s and Alzheimer’s disease co-pathology and behavior impairments发表在Neuron期刊上。

图源 Neuron

研究人员首先设计并建立了α-Syn N103和Tau N368小鼠模型，用于在肠神经系统中诱导表达转基因。由于Sox10（SRY-box containing gene 10）基因是神经嵴细胞发育过程中的关键转录因子，且在ENS中表达，因此研究团队使用Sox10-MCS4（多物种保守序列）作为增强子，用c-Fos最小启动子和RFP编码序列偶联SYN103^+/−基因或TAU368^+/−基因或两个基因，构建了Tet-on转基因小鼠系。由于四环素（tetracycline）几乎不穿透血脑屏障，因此使用四环素主要诱导ENS神经元中的转基因表达。为了诱导RFP标记的靶基因，研究人员每天通过口服灌胃方式给小鼠喂食10 mg/kg四环素，连续灌胃8周（0个月），并在口服灌胃后的0个月、2个月和10个月分析α-Syn N103和Tau N368的表达，并使用SOX10和PGP9.5（肠神经元标志物）的特异性抗体染色技术和GI组织切片染色技术等方法验证小鼠的整个胃肠道中诱导α-Syn N103和Tau N368的表达情况，并设计对照组排除各种可能的干扰因素。

图1 在SYN103^+/−、TAU368^+/−和Both的小鼠的结肠切片中，RFP信号与转导的α-Syn N103或Tau N368共定位于0、2和10个月

研究人员对结肠的不同时间点进行RFP和PGP9.5的共染色，验证RFP信号在肠神经元的表达情况；并使用免疫荧光染色（immunofluorescent, IF）检验α-Syn N103和Tau N368在肠神经元中的表达。通过定量分析结果表明，ENS诱导的α-Syn N103和Tau N368以时间依赖性方式增加，说明其诱导的α-Syn N103和Tau N368在肠神经丛中呈现积累状态，通过α-Syn N103和Tau N368片段与胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的阳性细胞进行共定位分析，其共定位结果很小，表明诱导的α-Syn N103和Tau N368 主要在神经元中表达。研究人员又进一步向部分小鼠静脉注射10 mg/kg F0502B/PBS溶液（F0502B是一种新型的α-Syn聚集PET示踪剂，具有荧光特性）以及硫黄素（thioflavin-S, ThS）溶液，使用离体染色方法分别观测到了α-Syn和Tau在肠道的聚集现象。

图2 四环素治疗8周后，肠神经元中α-Syn和Tau蛋白以时间依赖的方式聚集，从0个月开始出现胃肠功能障碍

研究发现，α-Syn和Tau蛋白质可以从肠系神经系统ENS传播到中枢神经系统（central nervous system, CNS），并在不同的大脑区域扩散。研究人员使用α-Syn N103和Tau N368抗体对大脑切片进行染色，并观察这些蛋白质在大脑中的分布。结果显示，α-Syn N103和Tau N368信号在0个月时出现在脑干和孤立核（nucleus of the solitary tract, NTS），并在2个月时扩散到其他大脑区域。研究人员还发现，α-Syn N103和Tau N368信号在大脑中的扩散与它们在肠系神经系统中的表达有关。这些结果支持了α-Syn和Tau蛋白质在神经退行性疾病中的传播机制。

图3 α-Syn N103和Tau N368在SYN103^+/−、TAU368^+/−及Both小鼠脑内的分布及定量分析

研究人员通过IF实验发现，α-Syn蛋白和Tau蛋白在小鼠脑中聚集并传播。结果显示，α-Syn蛋白在小鼠脑中的分布不仅限于某些区域，还扩散到其他区域，如ACC和EC皮层。同时，Tau蛋白也在小鼠脑中聚集，尤其是在DMV、NTS、LC（locus coeruleus）和SN区域。随着时间的推移，α-Syn和Tau蛋白的聚集密度增加，说明这些蛋白可以作为种子诱导内源性蛋白的聚集。

图4 α-Syn N103和Tau N368的聚集体在SYN103^+/−、TAU368^+/−及Both小鼠脑内的分布及定量分析

帕金森氏病的病理特征是SN中多巴胺能神经元的损失。研究人员发现，Both组别和SYN103^+/−的小鼠中TH阳性神经元的密度显著降低，且通过α-Syn N103与TH神经元共定位，表明TH神经元损失可能是由于α-Syn N103的扩散引起的。研究还发现，A-α-Syn和Tau诱导的神经元损失在不同的脑区都有着随着AD和PD病程的进展而加剧的趋势，且LC和NTS在表达α-Syn N103和Tau N368的双重突变小鼠中，神经元的损失情况更为严重，表明两种蛋白的共同表达可能加剧神经毒性。虽然DMV是α-Syn从肠道传播到中枢神经系统的关键区域，但其TH神经元损失较轻，但其NeuN阳性神经元却显著减少，表明α-Syn聚集可能对不同类型的脑细胞有不同的影响。

研究人员通过切断迷走神经（truncal vagotomy）来测试聚集的α-Syn和Tau是否通过迷走神经运输到大脑。结果表明，迷走神经切断后，大脑中α-Syn聚集显著减少，同时迷走神经切断组也观察到胆碱能神经元（ChAT-positive neuron）丢失。此外，迷走神经切断组中A-α-Syn或AT8信号也减少，而TH和NeuN的阳性细胞则增加，因此认为切断迷走神经可以减少大脑中的α-Syn和Tau聚集。

图5 免疫组化结果证实，迷走神经切除术后2个月，α-Syn N103和Tau N368在脑区的表达减少

为了确定小鼠模型中观察到的传播是否需要内源性α-Syn或Tau，或者仅仅需要α-Syn沿着迷走神经运输到大脑，研究人员使用人源α-Syn (S211)/Tau (HT7)标记染色来区分内源性小鼠蛋白和诱导的人类片段。

结果显示，人源性α-Syn或Tau蛋白可以在小鼠脑中传播，但并不需要小鼠自身的α-Syn或Tau蛋白；而且人源性α-Syn和Tau片段在大脑中的分布与小鼠内源性蛋白情不完全相同。进一步的实验表明，小鼠内源性α-Syn和Tau蛋白不是肠道聚集形成的必要条件，但它们在大脑中的病理传播中起着重要作用。在α-Syn或Tau基因敲除的小鼠中，病理传播的程度明显降低，特别是Tau蛋白的传播几乎完全被阻止，这表明Tau蛋白在传播中起着至关重要的作用，而α-Syn蛋白也参与了传播，但作用较小。

图6 SNCA-KO 小鼠或 MAPT-KO 小鼠注射提取的聚集原纤维后，注射部位的肠道中出现了聚集体，同时在脑区域也检测到少量聚集体

进一步的行为学实验发现，肠道诱导的α-Syn N103或Tau N368聚集体会引发不同的行为障碍。SYN103^+/−和Both组的小鼠在2-10个月内显示运动功能障碍，而Tau368^+/−小鼠与对照组无显著差异。Both组小鼠在10个月时显示空间学习障碍和记忆损害，而SYN103^+/−小鼠仅在10个月时显示记忆损害。Tau368^+/−组小鼠未显示任何缺陷。此外，研究还发现了认知功能障碍和抑郁样焦虑行为。

研究发现，肠道诱导的α-Syn N103或Tau N368聚集物会引起不同类型的行为障碍。实验结果显示，SYN103+/−和Both小鼠在2-10个月期间表现出运动功能障碍，而Tau N368小鼠则与对照组无显著差异。同时，Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）测试发现Both组小鼠在10个月时表现出空间学习能力显著下降。另外，新物体识别测试发现Both组小鼠和SYN103^+/−小鼠在0-10个月期间表现出识别记忆功能障碍，而TAU368^+/−组小鼠则在2-10个月期间表现出新物体探索时间减少。开放场测试（open field test）和尾悬试验（tail suspension test）结果还发现SYN103^+/−小鼠在0-10个月期间表现出焦虑样行为，而Both小鼠则在10个月时表现出焦虑样行为。因此认为，肠道诱导的α-Syn N103或Tau N368聚集体在病理传播到不同脑区后引起不同的行为缺陷。

图7 对SYN103^+/−、TAU368^+/−及Both小鼠进行运动和认知行为测试

研究人员使用¹⁸F-F0502B作为放射性示踪剂，通过PET-CT扫描检测α-Syn蛋白在肠道中的异常积累。结果显示，¹⁸F-F0502B在小鼠的肠道中显示出高信号，尤其是在SYN103^+/−小鼠的远端肠道中。研究人员还发现，14-20分钟后注射¹⁸F-F0502B是观察肠道内α-Syn信号的最佳时间窗口，且¹⁸F-F0502B能够作为指示剂很好地检测α-Syn蛋白在肠道和大脑中的异常积累。

图8 使用¹⁸F-F0502B对肠道和大脑中的α-Syn进行可视化和定量分析

研究人员建立了一种可诱导的转基因小鼠模型，在小鼠肠道神经系统中表达α-Syn N103或Tau N368片段，或同时表达两者。研究指出，这些由Syn和Tau截断的蛋白质片段会在肠道神经元中具有时间依赖性地聚集，而聚集的α-Syn和Tau通过迷走神经传播到脑干，并扩散到新皮质。且发现与单转基因小鼠相比，双转基因小鼠表现出更广泛的传播和更严重的神经元损失。这些小鼠还出现了运动和认知障碍，与帕金森病和阿尔茨海默病患者观察到的行为障碍相似。此外，研究人员发现，α-Syn PET示踪剂¹⁸F-F0502B可以检测到肠道和大脑中的α-Syn聚集情况，这为临床上早期诊断帕金森病提供了新的可能性。未来，通过早期干预阻止Syn与Tau的聚集体病理性地从肠道向大脑传播，可能有助于治疗这些严重的神经退行性疾病。这项研究为理解帕金森病和阿尔茨海默病的发病机制提供了新的见解，并为早期诊断和治疗提供了新的靶点和可能性，为进一步探究这两种疾病的共病机制和寻找新的治疗方法奠定了基础。

找实验方法，上脑声常谈

Neuron丨从肠到脑，帕金森和阿尔茨海默的“双重”麻烦