间充质干细胞外泌体可缓解肝纤维化

尽管人们对肝脏纤维化的细胞和分子机制有了越来越多的了解,但目前尚无批准用于治疗肝纤维化的西药。间充质干细胞(MSCs)作为一种多能祖细胞,是治疗组织损伤和炎症的有吸引力的治疗手段。近日,一项发表于Hepatology International的研究确定了人脐带血来源的MSCs(UC-MSCs)对硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化的保护作用及其机制。

研究者通过腹腔注射TAA诱导小鼠肝纤维化,随后通过尾静脉给部分小鼠注射UC-MSCs或UC-MSCs衍生的外泌体(UC-MSCs-Exo),取肝脏组织进行组织学分析。

UC-MSCs和UC-MSCs-Exo的鉴定与表征

研究者从人脐带组织中分离出UC-MSCs,呈纺锤形,具有贴壁生长的特性,能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。流式细胞术分析显示,UC-MSCs高表达CD90、CD105和CD73,而几乎不表达CD34、CD19、CD45和HLA-DR。

通过透射电子显微镜观察从UC-MSCs中成功分离出的UC-MSCs-Exo,观察结果显示,纯化后的外泌体呈典型的盘状形态,被脂质双层膜包裹,平均直径范围在30~150 nm之间,表达Alix和CD9,而不表达Calnexin。


可减少TAA诱导的肝脏炎症并改善肝功能

研究者在TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中评估了分离的UC-MSCs-Exo的有效性。苏木精-伊红(H&E)染色显示,与对照小鼠相比,TAA处理的小鼠肝脏组织中炎性细胞浸润显著增加。而UC-MSCs或UC-MSCs-Exo治疗的小鼠肝脏中炎性细胞浸润明显减少(图1a)。生化分析显示,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后,小鼠血清ALT和AST水平显著降低(图1b、1c)。

随后,研究者通过qRT-PCR检测了肝脏组织中促炎介质的表达。与PBS处理的对照组相比,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗降低了肝脏组织中促炎细胞因子和趋化因子(包括TNF-α、IL-6和Mcp-1)的mRNA水平(图1d~1f)。同时,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组肝脏中Adgre1的表达也显著降低(图1g)。因此,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗均改善了肝功能并减轻了肝脏炎症。

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图1. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可减轻TAA诱导的小鼠肝脏炎症并改善肝功能(源自文献)


可减轻肝纤维化

天狼星红染色和Masson三色染色显示,与对照组相比,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组小鼠的胶原沉积显著减少(图2a、2b)。α-SMA是肝纤维化和肝星状细胞(HSC)激活的一个特异性标志物,免疫荧光染色显示,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后α-SMA表达明显降低(图2c)。同时,研究者通过qRT-PCR检测了肝脏组织中编码纤维化因子的基因(包括Acta2、Col1α1、Col3α1和Timp1)的mRNA水平,结果显示,这些基因在UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗组中的表达显著降低(图2d~2g)。这些结果表明,无论是UC-MSCs还是UC-MSCs-Exo治疗均显著减轻了TAA诱导的小鼠肝纤维化。

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图2. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可减轻肝纤维化(源自文献)


可抑制纤维化肝脏中SMO的表达

GEO数据库分析显示,TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中肝脏组织SMO的mRNA水平显著高于对照组。然而,在恢复后的肝脏中,SMO表达显著降低(图3a)。进一步分析显示,肝脏中SMO的mRNA水平与Col1α1和Acta2的mRNA水平呈正相关(图3b、3c)。

通过Western blot分析肝脏组织中的SMO蛋白水平,结果显示TAA处理后肝脏中SMO表达增加,而UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗后SMO表达显著降低(图3d)。免疫荧光染色进一步证实,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗显著抑制了肝脏中SMO的表达(图3e)。这些结果表明,UC-MSCs和UC-MSCs-Exo通过抑制SMO表达来发挥治疗作用。

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图3. UC-MSCs和UC-MSCs-Exo治疗可抑制纤维化肝脏中SMO的表达(源自文献)

UC-MSCs-Exo通过抑制Hedgehog/SMO通路抑制HSC激活

研究者通过体外实验进一步研究了UC-MSCs-Exo抗纤维化作用与Hedgehog/SMO通路之间的关系。Western blot分析显示,TGF-β处理后LX2细胞中α-SMA表达显著上调,而UC-MSCs-Exo治疗显著抑制了α-SMA的表达。同时,UC-MSCs-Exo治疗降低了LX2细胞中SMO和Gli1的表达。免疫荧光染色结果一致,UC-MSCs-Exo治疗抑制了LX2细胞中α-SMA、SMO和Gli1的表达。此外,UC-MSCs-Exo治疗降低了LX2细胞中Hedgehog靶基因(包括Ptch1、Gli1和Cyclin D1)的mRNA水平。研究者进一步用SMO激动剂SAG预处理LX2细胞,结果显示,UC-MSCs-Exo介导的HSC激活抑制被SAG处理逆转。


UC-MSCs-Exo的治疗效果在体内被SAG处理逆转

为了在体内进一步证实UC-MSCs-Exo通过靶向Hedgehog/SMO信号通路减轻肝纤维化,研究者在TAA诱导的纤维化小鼠中注射了SMO激动剂SAG。H&E染色和血清ALT/AST水平生化分析显示,与仅接受UC-MSCs-Exo治疗的小鼠相比,SAG+UC-MSCs-Exo处理组小鼠的肝损伤增加,并伴随促炎介质(包括TNF-α、IL-6、Mcp-1和Adgre1)表达的增加。天狼星红染色和Masson三色染色显示,SAG处理逆转了UC-MSCs-Exo在TAA诱导的纤维化小鼠中的抗纤维化作用。同时,研究者检测了肝脏组织中编码纤维化因子的基因表达,结果显示SAG+UC-MSCs-Exo处理组小鼠中Acta2、Col1α1、Col3α1和Timp1的mRNA水平显著上调。

总的来说,该研究表明UC-MSCs-Exo通过抑制Hedgehog/SMO信号通路发挥对肝纤维化的治疗作用。

参考文献:Zong R, Zheng Y, Yan Y, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes alleviate liver fibrosis by targeting Hedgehog/SMO signaling. Hepatol Int. Published online August 13, 2024. doi:10.1007/s12072-024-10717-y