一文掌握：侵袭性霉菌感染实验室诊断6大类常见问题 | 临床必备

医脉通呼吸科

2024-09-24 18:10发布于北京医脉通呼吸科官方账号

侵袭性真菌病发病率在世界范围内逐渐增加，世界卫生组织和美国疾病预防控制中心相继发布了重要文件，呼吁提高对侵袭性真菌病的重视程度和认知水平，以应对侵袭性真菌病对全球造成的威胁。霉菌是侵袭性真菌病的重要病原菌之一，且发病率高、死亡率高，临床诊断和治疗面临极大挑战。


为更好地提升我国侵袭性霉菌感染实验室诊断能力，解决实验室工作中最常见、最困惑以及与临床交流最多的问题，通过问卷调查收集到来自全国76位临床和检验医师的共207个问题。经过归纳分类后，整理出6大类最常见问题，并由专家组形成推荐意见。


（一）霉菌检测阳性，如何判断是污染菌、定植菌还是致病菌

1. 直接镜检霉菌阳性，如何判断是污染菌、定植菌还是致病菌？

建议1：直接镜检阳性时，应首先区分标本来自无菌部位还是非无菌部位。无菌部位标本（血液标本除外）直接镜检有特征性菌丝和孢子且与组织病理结果、真菌培养结果相符，可确诊为致病霉菌；非无菌部位标本直接镜检到霉菌，要结合培养结果、血清学检测结果、患者流行病学史和临床感染表现等综合分析。

2. 培养霉菌阳性时，如何判断是污染菌、定植菌还是致病菌？

建议2：培养霉菌阳性时，重点关注送检标本类型，直接镜检、组织病理检查与霉菌阳性培养的一致性，以及霉菌致病性、感染部位等。无菌标本如血培养为曲霉菌属或毛霉菌目，污染菌的可能性大；如为镰刀菌属、赛多孢菌属和马尔尼菲篮状菌，可能为致病菌。非无菌标本，视情况而定：2个试管有单一形态真菌生长，真菌镜检同时阳性者提示有临床意义；仅1管生长真菌，生长部位为非接种部位，菌落为霉菌样则可能是污染；培养出的真菌与直接镜检和组织病理学检查表现相符，连续培养阳性，且真菌具备36~37℃生长的能力提示有临床意义。

（二）不同检测结果不一致问题

1. 临床怀疑真菌感染，实验室相关检测阴性，可从哪些方面与临床沟通？

建议3：分析前应评估标本留取是否规范并适于特定检验项目；分析过程应评估镜检和/或培养方法检测敏感性是否充分、培养条件是否适宜、所选检测项目是否适于检测疑似真菌类型（如G试验不能检测隐球菌和毛霉菌目）；分析后过程应结合组织病理学或影像学结果，参考其他感染指标结果（如C反应蛋白、降钙素原），分析是否存在导致血清学结果假阴性的因素等。

2. 如何解释镜检和/或培养结果与血清学检测（G试验、GM试验）结果不一致？

建议4：鉴于真菌体内增殖及血清标志物出现时间不同，不同感染期血清学与镜检和/或培养结果常不一致。血清学检测方法敏感性常高于传统镜检、培养方法，而单纯培养结果常难区分感染、定植或污染。此外，应考量是否存在导致血清学结果假阳性或假阴性的因素以及宿主免疫功能。

（三）血清学检测相关问题

1. 血清学检测常见干扰因素有哪些？

建议5：血清学检测假阳性因素包括药物因素（血液制品如静脉输注免疫球蛋白等）、医疗因素（纤维素膜血液透析）、宿主因素（细菌菌血症）、样本因素（如采血管污染或过度操作）、方法学因素（传统鲎试剂法干扰因素多）等；假阴性因素包括使用抗真菌药物、脂血或黄疸样本等。实际应用过程中应尽量排除干扰因素的存在，并谨慎评估对结果的干扰影响。

2. 如何解释血清G试验与GM试验结果不一致？

建议6：G试验与GM试验检测标志物不同，G试验是泛真菌检测，而GM试验为曲霉菌特异性抗原检测；另外，2种标志物的释放时间和释放量的不同也可能导致二者结果不一致，例如1，3-β-D葡聚糖只有被吞噬细胞吞噬处理后才被释放出来，而GM是表达在曲霉菌细胞壁表面的一种多糖成分，在曲霉菌繁殖生长时由菌丝释放出来。因此，在感染早期，曲霉菌的生长分泌强于死亡消化裂解，可出现GM试验阳性，而G试验未达到阳性水平；粒细胞缺乏患者，不能将1，3-β-D葡聚糖从真菌中释放出来，也可导致二者检测结果不一致。

3. 如何解释血清与BALF的GM试验结果不一致？

建议7：二者检测的敏感性、特异性不同，可能会导致检测结果的不一致。GM试验对免疫抑制患者IA检测敏感性高，BALF样本敏感性优于血清样本 。另外BALF样本采样和处理的标准化问题（灌洗量、回收量、血性、痰性、灌洗技术等）对GM试验结果的影响很大。

（四）mNGS检测相关问题

1. mNGS检测霉菌相比于传统检测方法的优势有哪些？

mNGS检测敏感性高，更适合混合感染病例的病原学检测，多项侵袭性真菌感染的研究表明mNGS检测阳性率高于传统检测，且对免疫缺陷患者和混合感染时较传统检测更具优势。外周血可作为深部组织器官真菌感染的mNGS检测样本：侵袭性真菌感染可累及多种组织和器官。当感染部位样本获取困难时，外周血可作为替代样本进行检测。mNGS可作为少见真菌或培养困难真菌的平行检测手段，如毛霉菌目、组织胞浆菌、拟青霉等。

建议8：对免疫功能低下、疑似混合感染、传统检测阴性或疑似少见真菌感染患者，在进行传统微生物学检测的同时留取样本进行mNGS检测。外周血样本检测敏感性低于感染部位样本，因此在不能获得感染部位样本时可进行替代检测，检出真菌应结合临床谨慎评估。

2. mNGS检测有哪些局限性？

真菌的细胞壁相对较厚，mNGS可因破壁效率低而影响核酸提取效率，且检测性能可因真菌类型、临床样本种类及实验流程差异而有所不同。有研究显示IA患者的BALF样本其mNGS检测敏感性低于GM检测。公共数据库中真菌信息的准确性和完整度低于细菌及病毒，已有的核酸序列质量参差不一，可导致结果假阴性或真菌鉴定准确率降低。对于检出的非常见真菌类型，应进行其他方法的验证，如一代测序或靶向PCR检测。mNGS假阳性较常见，主要原因为湿试验过程引入微生物核酸及生信分析错配，前者更常见。湿试验所致假阳性原因包括样本采集环节、实验室环境背景菌以及样本间污染。

建议9：mNGS假阳性率高于传统微生物学检测，仅mNGS检出真菌不应作为真菌感染的诊断依据，应对检出真菌进行其他方法验证，并需结合临床谨慎评估。与此同时，因真菌结构特点及数据库原因，mNGS可存在假阴性结果，mNGS阴性不应作为排除真菌感染的标准。

3. 当临床考虑IFD时，如何解释镜检、培养、血清学检测与mNGS检测结果不一致？

不同方法学的诊断性能存在较大差异。（1）传统微生物学未检出真菌，而mNGS检出：与培养、镜检方法相比，mNGS的敏感性较高，需结合临床考虑检出真菌是否为致病菌，同时应考虑送检其他真菌相关检测以验证mNGS结果。（2）传统微生物学检出真菌，而mNGS未检出：无菌样本培养和/或镜检检出霉菌，应充分考虑致病菌可能，mNGS可因真菌细胞壁较厚、人源背景高等原因造成漏检。

建议10：当临床考虑IFD时，应充分考虑阳性结果检出，结合未检出的检测方法性能特征考虑漏检可能，有条件情况下进行重复检测或重新采集样本检测。

（五）霉菌体外药敏试验相关问题

1. 霉菌是否均需常规开展体外药敏试验？

建议11：微生物实验室在条件适宜的情况下，尽量开展重要病原真菌的体外药敏试验，为临床用药提供指导，具体用药原则建议由临床相关科室、微生物实验室、药剂科、感控部门共同讨论决定。特别是下列情况，实验室应该开展体外药敏试验：（1）建立致病性霉菌抗菌谱和耐药性监测。（2）使用标准剂量的抗霉菌药物治疗失败的患者。（3）临床上已有临床耐药菌株报道。（4）曾接触过抗真菌类药物或正在接受长期抗真菌治疗的患者。

接受抗真菌治疗的患者发生深度感染、治疗失败的情况下，若无菌部位分离出霉菌菌种为罕见或新出现的菌种，或怀疑特定菌种可能对所使用的抗真菌药物耐药的情况下，应优化患者个体化治疗，根据流行病学调查等情况，建议进行体外药敏试验。

2. 对无判定折点的药敏结果，如何向临床发送报告？

建议12：如分离出高度疑似或确诊为病原体的霉菌，应尽量向临床提供体外药敏试验结果。药敏试验暂无判定折点的霉菌也需提供体外药敏试验的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。

由于诸多因素，目前美国临床实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）、欧洲抗微生物药物敏感试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）以及我国对多数霉菌缺乏临床药敏试验判读折点。对已有规范化体外药敏试验方法的霉菌（如曲霉、毛霉、镰刀菌、赛多孢、孢子丝菌、皮肤癣菌等），可按照抗丝状真菌药物敏感性试验肉汤稀释法标准（WS/T411-2024）向临床提供体外药敏试验MIC值，临床可结合抗真菌药物的血药谷浓度和峰浓度值，选择相应的药物种类和剂量。对于尚无规范化体外药敏试验方法的霉菌（如暗色真菌等），可参考类似菌体外药敏试验方法测定其MIC值，报告临床，并注明体外药敏试验非标准化方法操作，此结果仅供参考。

（六）如何保证侵袭性霉菌实验室检测的生物安全，避免实验室污染？

建议13：霉菌实验室不应与细菌、结核实验室共用，应单独设置；霉菌检测需在Ⅱ级生物安全柜内进行，特别是可疑高致病性病原真菌；紫外线仍然是必备的空气消毒设备；定期使用高锰酸钾或甲醛熏蒸24h，对空气进行消杀；每天实验完成后用0.5%过氧乙酸或含氯消毒剂（500mg/L）消毒。如遇操作台被真菌或标本污染，应立即覆盖纸巾，并用含氯消毒液（500mg/L）消毒20min。一旦实验室环境或培养箱发生污染，应立即停止实验操作，对实验室或培养箱进行彻底消毒，可用含氯消毒液（500mg/L）进行表面消毒擦拭，然后进行过氧乙酸或甲醛熏蒸，熏蒸后再进行表面消毒，连续3d监测实验室或培养箱空气质量和表面染菌量，确认无污染后方可重新启用。

来源：“感染前沿”公众号