在猪德尔塔冠状病毒入侵细胞的分子机制研究领域取得重要进展
近日，华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院、农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室李文涛教授团队在猪德尔塔冠状病毒入侵细胞的分子机制研究领域取得重要进展。相关成果以“Genome-wide CRISPR/Cas9 library screen identifies C16orf62 as a host dependency factorfor porcine deltacoronavirus infection”为题在Emerging Microbes & Infections期刊上发表。
猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV），是一种新型猪肠道冠状病毒, 主要感染新生仔猪，引起腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，给全球养猪业带来巨大经济损失。此外，据报道，从海地三名发热儿童血清样本中检测并分离到了PDCoV，表明该病毒具有跨种传播的风险。PDCoV 主要通过S蛋白与细胞受体/共受体结合，从而介导病毒入侵宿主细胞。前期团队研究表明，PDCoV以氨基肽酶N（APN）作为细胞受体，但APN的敲除并不能完全阻止病毒的感染，提示还有其他受体或辅助受体参与了病毒感染过程。
为发掘PDCoV的受体及感染相关的宿主因子，研究人员将 PDCoV 感染 CRISPR/Cas9 敲除慢病毒文库转导的易感细胞-人肝癌 Huh7 细胞，并对存活细胞进行高通量测序（NGS）和基因富集分析，发现除了已知受体基因 ANPEP，还有 C16orf62 等多个参与病毒感染过程的基因显著富集。通过在猪源细胞进行基因敲除和病毒感染试验证实 C16orf62 是PDCoV 吸附过程中重要的宿主因子。尽管没有发现C16orf62与PDCoV S蛋白的直接互作关系，但经过验证发现，C16orf62 敲除细胞系APN的表达下调。进一步通过TGEV S1在C16orf62敲除细胞系上进行表面染色以及接种TGEV验证，发现C16orf62敲除细胞表面APN丰度降低。最后进行Co-IP验证及共聚焦观察发现C16orf62与APN可以相互作用。表明C16orf62作为异源逆向囊泡转运复合物retriever的核心组分，可通过调节细胞膜上已知受体APN的分布，间接影响PDCoV的吸附而参与PDCoV的感染过程。
研究揭示了C16orf62为PDCoV感染细胞的必需宿主因子，为进一步揭示冠状病毒的致病机理奠定基础，为抗冠状病毒药物的研制和抗病育种提供潜在的靶标。
华中农业大学博士生马宁宁和博士后张梦佳为文章共同第一作者，李文涛教授和荷兰乌特勒支大学Berend Jan Bosch教授为通讯作者。感谢何启盖教授和荷兰乌特勒支大学医学中心Robert Jan Lebbink博士对本研究提供的重要指导意见和建议。
近日，华中农业大学稻曲病研究团队联合安徽农业大学在Nature Communications上在线发表了题为“A secreted fungal laccase targets the receptor kinaseOsSRF3 to inhibit OsBAK1–OsSRF3-mediated immunity in rice”的研究论文。该论文首次解析了真菌分泌性漆酶的致病机理，鉴定到一个水稻免疫相关类受体激酶OsSRF3，对研究植物先天免疫机制和创制新的水稻广谱抗病材料具有重要价值。稻曲病是世界水稻生产中的主要病害之一，不仅造成稻米产量损失，且稻曲球中产生的毒素对动物细胞具有毒性和致畸作用，严重威胁粮食安全。在我国，稻曲病发生尤为严重，年均发生面积4500万亩、减产超1.5亿公斤。培育抗稻曲病品种被认为是目前最经济有效的防治措施，但现阶段抗稻曲病品种和抗性基因资源严重缺乏，很难鉴定到优异的主效抗性位点。因此，如何高效挖掘和鉴定稻曲病优异的抗病蛋白是未来稻曲病持久绿色防控的关键瓶颈问题。植物与病原菌互作过程中，植物本身进化出一套有效的先天免疫系统来抵御病原菌的侵染，主要包括PTI和ETI两个免疫层次。病原菌侵染植物后，植物细胞表面模式识别受体通过识别PAMP来激活第一层PTI反应；而成功突破第一层PTI免疫屏障的病原菌则通过分泌毒性效应蛋白造成植物感病，即ETS。为应对病原菌这一策略，植物会利用抗病（R）蛋白来特异性识别效应蛋白，从而触发第二层ETI反应。ETI与PTI反应的理论框架构成了经典认知的Zig-zag模型。用稻曲菌效应蛋白挖掘与之对应的水稻免疫相关蛋白，根据其抗病机制服务作物抗性设计改良；这是当前培育优良抗稻曲病品种的重要途径之一。本研究发现稻绿核菌素合成酶UgsL是稻曲病菌致病关键效应子，具有典型的漆酶活性，基因敲除后突变体致病力完全丧失。异源表达UgsL可以抑制水稻引起的免疫反应，而靶向UgsL进行寄主诱导的基因沉默则增强水稻的抗病能力。通过筛选和互作验证发现UgsL与水稻类受体激酶OsSRF3在细胞膜上互作，OsSRF3基因编辑和过表达不会影响水稻的农艺性状，但正调控水稻对稻曲病、稻瘟病、纹枯病和白叶枯病的广谱抗病性。一系列体内、体外生化试验证明UgsL可通过泛素化-26S蛋白酶体促进OsSRF3降解，并且UgsL漆酶活性影响OsSRF3稳定性。油菜素类固醇受体相关激酶OsBAK1与OsSRF3相互作用，体外实验发现OsBAK1可以直接磷酸化OsSRF3，体内实验证明Ser670位点的磷酸化促进了OsSRF3的稳定性和植株抗病性。进一步实验发现UgsL能够与OsBAK1竞争性结合OsSRF3，导致OsBAK1对OsSRF3的磷酸化修饰水平降低，进而影响OsSRF3稳定性，从而抑制OsBAK1–OsSRF3介导的免疫反应。 稻曲菌分泌性漆酶UgsL抑制OsBAK1-OsSRF3介导水稻免疫的工作模型综上所述，在稻曲菌侵染过程中，水稻质膜上的OsBAK1-OsSRF3复合物识别稻曲菌分泌的PAMPs后，OsBAK1磷酸化OsSRF3去激活MAPK信号和ROS爆发，诱导防御相关基因的表达，从而增强水稻免疫反应。作为致病策略，稻曲菌分泌具有漆酶活性的效应子UgsL与OsSRF3相互作用，并通过泛素化-26S蛋白酶体促进其降解，从而抑制OsBAK1–OsSRF3介导的免疫途径。华中农业大学植物科学技术学院博士生段宇航、安徽农业大学王招云副教授为论文共同第一作者。安徽农业大学陈晓洋教授、华中农业大学郑露副教授为论文共同通讯作者；华中农业大学黄俊斌教授、罗朝喜教授、陈小林教授、刘浩副教授、毕业硕士裴张新、博士生胡虹、广西大学徐秋涛教授、安徽农业大学博士生方圆也参与了该项研究。
构建SAM关键homeobox基因调控网络解析玉米株高发育的分子机制
近日，华中农业大学植物科学技术学院李林教授团队联合西北农林科技大学薛吉全教授团队在Genome Biology在线发表了题为“A dynamic regulome of shoot-apical-meristem-related homeobox transcription factors modulates plant architecture in maize”的研究论文。该研究从玉米自交系B73中收集了46个转录组和16个翻译组数据集，结合tsCUT&Tag、ATAC-seq和机器学习模型，成功绘制了SAM关键homeobox TFs的基因调控网络，全面系统解析了homeobox TFs调控株高功能基因的分子机制。该调控网络为深入系统剖析控制玉米SAM生长发育和株型形态建成的潜在分子机制提供了可能。茎顶端分生组织（SAM）作为植物地上组织的来源，对植物形态发生和发育至关重要。已有的关于玉米功能突变体的研究揭示了若干与SAM生长发育及分化相关的关键基因，其中很大一部分属于homeobox转录因子家族基因。Homeobox TFs在生物体的生长发育中扮演的复杂调控角色，如Kn1、Rs1和Gn1等基因的功能重要性等已在多种植物物种中得到证实。Homeobox家族转录因子（TFs）通过与靶基因互作构成复杂的转录调控网络，调控植物细胞内众多生物学过程，Homeobox家族调控组的研究有望深化对植物发育机制的理解。研究团队首先收集了一组已报道的影响SAM生长分化的功能基因（图1A），基于实验室前期已发表的玉米多组学整合网络(Han et al 2023)，通过其在共表达和共翻译水平上的互作，筛选了已知SAM功能基因的直连分子网络（图1B）。该分子网络基因显著富集在KNOX、WOX和ZF-HD亚家族，表明这些亚家族可能在SAM的生长分化中发挥重要的作用（图1C）。为深入解析玉米SAM相关转录因子（TFs）在组织分化和发育中的分子机制，该研究对3个TF亚家族进行了tsCUT&Tag实验，共鉴定出30,915个可重复的TF结合位点。基于tsCUT&Tag数据构建了28个玉米SAM相关homeobox转录因子的基因调控网络，包含235,043个边和18,463个节点。该网络为进一步解析玉米SAM相关homeobox转录因子的功能提供了宝贵资源。图1 与已知SAM功能基因共表达和共翻译的基因富集情况为构建组织特异性动态调控网络，基于黄化幼苗叶片ATAC-seq和tsCUT&Tag数据，团队设计并训练了一个机器学习模型，以预测SAM组织的调控位点。最后集成多个数据集构建了SAM动态网络（图2A）。该网络主要富集与“分生组织发育”“分生组织起始”“分生组织维持”“芽系统发育”“激素介导的信号通路”（赤霉素、乙烯和生长素）“组织发育”（花、果实、种子、叶）和细胞分化相关的基因（图2B）。这些发现突显了SAM动态网络的生物学意义，并为迄今为止未分类基因的功能提供了新的见解。图2 Homeobox TFs的SAM动态调控网络株高是重要的理想株型农艺性状之一，其被复杂的调控机制所影响。该研究系统整理了已发表与株高相关的功能基因，并将这些基因按照功能模块化的特点，划分为多个生物学途径模块（图3A），最终生成了包含homeobox TFs与78个已知株高功能基因的株高功能网络，充分展示了homeobox TFs如何通过多种不同的生物学途径对植株高度产生影响，并且大多数株高功能基因似乎也都受到了多个homeobox TFs的调控和影响（图3A-3C）。例如，生长素合成途径中的Vt2基因同时受到KNOX亚家族的两个成员Knox6和Hb20的调控，同时Knox6还可以调控Hb20基因的表达。这些证据揭示了homeobox TFs控制植株高度的分子网络的复杂性（图3D-3F）。
图3 Homeobox TFs与已知株高基因的株高功能网络为了测试从网络预测到的基因功能，进而解析调控株高的分子网络。研究利用CRISPR/Cas9编辑敲除，成功获得wox13a功能丧失突变体。结果显示，突变体植株的株高和穗位高都显著降低。结合tsCUT&Tag和突变体RNA-seq分析，鉴定到一个下游靶标为经典株型功能基因Gn1，进一步实验证实了WOX13A诱导Gn1表达，调控玉米的株高发育。华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室已毕业博士罗姿（现湖南省农科院），已出站博士后吴雷明（现安徽农业大学教授）和博士研究生苗馨心为该论文的第一作者，华中农大李林教授和西北农林科技大学薛吉全教授团队徐淑兔副教授为通讯作者，中山大学杨芳教授也参与了该研究工作。该研究在早期阶段获得了明尼苏达大学Gary J. Muhelbauer教授的帮助与指导。在机器学习相关模型的构建中，华中农业大学人工智能团队李伟夫副教授和吴昊博士生为研究提供了帮助。