编者按：猴痘病毒最早于1958年在实验室中的动物身上被发现，主要流行于中非和西非地区。但自2022年5月以来，猴痘在多个非传统流行国家及地区出现大规模流行和暴发，并出现人际传播，引发广泛关注。在此背景下，快速、准确的诊断技术显得尤为重要。本期“结核之窗”栏目，卢水华教授团队介绍一项研究，该研究利用CRISPR技术开发了一种名为SCOPE的猴痘病毒快速检测平台。该平台不仅简化了检测流程，还大大提高了检测的灵敏度和效率，有望为猴痘疫情防控提供新的有力工具。
研究简介
一、研究背景
猴痘病毒，自1958年被发现以来，一直是一种罕见但潜在致命的人畜共患病。2022年，一场突如其来的疫情让猴痘病毒成为全球关注的焦点，报告病例超过90 000例，世界卫生组织（WHO）甚至将其列为“国际关注的突发公共卫生事件”。猴痘的症状与天花相似，包括发热、头痛、皮疹等，虽然大多数人能在几周内康复，但部分患者可能发展成严重疾病，甚至死亡。
猴痘病毒的传播途径多样，包括接触受感染动物的体液或皮肤病变，以及人际间的传播。这种病毒主要在中非和西非流行，但2022年的疫情显示了它传播到非洲以外地区的能力。面对猴痘病毒的挑战，快速、灵敏、易于操作的诊断工具至关重要，但现有的检测方法如qPCR等，往往需要昂贵的设备和专业的技术人员，且检测耗时长。
为了解决这一难题，科学家们一直在探索新的诊断技术。CRISPR这一荣获诺贝尔奖的基因编辑技术，现在被用于开发快速、超灵敏的猴痘病毒检测平台--SCOPE。这一技术通过简化的样本处理和CRISPR一步法反应，能在15分钟内完成从样本到结果的全过程，灵敏度达到单分子级别，即使在资源有限的环境中也能发挥出色的检测能力。这项突破性的进展不仅有望提高猴痘疫情的防控效率，还可能推动CRISPR技术在更广泛疾病诊断领域的应用。
二、研究思路与实验结果
1. SCOPE检测系统的工作原理
SCOPE（Streamlined CRISPR On Pod Evaluation platform）的创新之处在于通过一个简化的流程实现猴痘病毒的快速检测。首先，通过一个特制的免提取裂解步骤，病毒核酸从样本中快速释放。然后，一个10分钟的RPA-CRISPR/Cas13a一步法反应迅速识别目标DNA。整个反应过程无需复杂设备，通过一个便携式设备CPod即可完成，实现了从样本到结果的快速转换。
图1. 使用SCOPE对猴痘病毒检测的示意图以及操作流程图
2. RPA-CRISPR/Cas13a一步法检测体系的优化
为了提高检测的灵敏度和效率，研究团队对RPA-CRISPR/Cas13a一步法检测体系进行了细致的优化。通过调整关键反应组分rNTP、T7 RNA聚合酶、引物、LwaCas13a、crRNA, RNase H的浓度来优化反应条件的过程。这些优化使得检测系统能够更有效地放大猴痘病毒DNA的信号，从而实现对极低浓度猴痘病毒样本的检测。
图2. RPA-CRISPR/Cas13a一步法检测体系的优化
3. 猴痘病毒免提取条件的优化
简化样本处理流程是实现快速检测的关键。图3描述了该研究团队如何优化猴痘病毒裂解步骤，从而快速释放病毒核酸。通过调整裂解温度和时间，研究者发现在80°C下裂解2分钟即可达到最佳效果。此外，还优化了裂解缓冲液与临床样本的比例，即疱疹拭子: 9:1，咽拭子: 3:1，唾液: 1:3，尿: 9:1，这进一步提高了检测的灵敏度和效率。另外，还优化了裂解后样本加样量，最优的加样量为7 μL。
图3. 猴痘病毒免提取条件的优化
4. CPod设备组成图
为了使SCOPE系统在资源有限的环境中也能使用，研究者开发了一个名为CPod的便携式分析设备。图4展示了CPod的设计和制造过程，包括其机械和电子组件的精心设计。CPod不仅体积小、成本低，而且操作简便，可以通过智能手机应用程序无线控制，使其成为一个理想的现场快速检测工具。
图4.CPod设备组成图
5. SCOPE分析性能的评估
研究者深入探讨了SCOPE的检测能力，包括其检测限和特异性。通过一系列实验，研究者证明了SCOPE能够检测到低至0.5拷贝/μL（2.5 copies/test）的猴痘病毒DNA，且与实时PCR的检测结果100%一致。此外，SCOPE在检测其他正痘病毒和类似症状病毒时未显示出交叉反应，证明了其出色的特异性。
图5. SCOPE分析性能的评估
6. SCOPE临床样本验证
研究者验证了SCOPE系统在临床样本检测中的有效性。即采用SCOPE对102个临床样本进行了测试，包括35个猴痘病毒阳性样本、19个单纯疱疹病毒样本和48个健康人阴性样本。结果显示SCOPE的检测结果与实时PCR完全一致，证明了其在实际临床环境中的可靠性和有效性。
图6. SCOPE临床样本验证
三、研究结论
这项工作成功开发了一种名为SCOPE的猴痘病毒检测平台，它以其快速、超灵敏、简便和便携的特性，标志着传染病检测技术的重大突破。
SCOPE系统能够在短短15分钟内提供检测结果，这一速度对于控制病毒传播至关重要。它能够检测到低至0.5拷贝/μL（2.5 copies/test）的病毒DNA，即便是在病毒载量极低的情况下也能准确诊断，有助于患者的早期发现和治疗。更令人印象深刻的是，SCOPE的操作流程大大简化，无需复杂的设备和专业人员即可进行检测，这使得它在资源有限的环境中也能大显身手。
此外，SCOPE系统配备的便携式检测设备CPod，进一步增强了其实用性。它的小巧身材和易用性意味着，无论是在偏远地区还是在城市诊所，都能快速部署并使用。在临床样本测试中，SCOPE展现了与金标准实时PCR相媲美的准确性和特异性，证明了其在实际应用中的可靠性。
研究点评
猴痘病毒作为一种人畜共患的病原体，自2022年的全球爆发以来，引起了广泛的公共卫生关注。快速、准确的诊断对于控制疫情至关重要。现有的诊断方法如qPCR虽然准确，但需要专业的实验室设备和技术人员，限制了其在现场快速检测中的应用。因此，开发一种快速、灵敏、易于操作的猴痘病毒检测技术具有重要的实际意义和迫切的临床需求。
研究亮点与创新
本研究的亮点在于利用CRISPR技术，特别是Cas13a系统，开发了一种名为SCOPE的单步检测平台。该平台能够在几分钟内完成从样本处理到结果输出的全过程，大大缩短了检测时间。此外，研究团队还设计了一种便携式检测设备CPod，使得检测工作无需专业实验室设备即可完成，提高了检测的可及性和便利性。
研究的主要发现和临床意义
研究的主要发现是SCOPE平台能够实现对猴痘病毒的超灵敏检测，检测限达到0.5拷贝/μL（2.5 copies/test），且检测结果与实时PCR高度一致。这一发现具有显著的临床意义，因为它不仅能够提高猴痘病毒检测的效率，还有助于在资源有限的环境中快速识别和隔离病例，从而更有效地控制疫情。
研究局限性
尽管SCOPE系统在实验室测试中表现出色，但研究的局限性在于其临床样本量相对较小，且主要来自男性患者。因此，该技术在更广泛人群和不同环境下的适用性和准确性还需要进一步验证。此外，CPod设备的长期稳定性和耐用性也有待在实际应用中进行评估。
未来的研究方向
未来的研究可以在以下几个方向进行：扩大临床样本的测试范围，包括不同性别、年龄和种族的人群；优化检测流程，进一步提高检测的灵敏度和特异性；探索SCOPE系统在其他传染病检测中的应用；以及对CPod设备进行长期稳定性和耐用性评估。
研究总结
总之，这项研究在猴痘病毒检测领域取得了显著进展，展示了CRISPR技术在快速诊断传染病方面的潜力。SCOPE系统的开发不仅提高了猴痘病毒检测的效率，也为未来可能出现的其他传染病提供了一种新的检测策略。尽管存在一些局限性，但随着技术的不断优化和应用范围的扩大，SCOPE系统有望成为全球公共卫生领域的重要工具。
▌参考文献：
Wang Y, Chen H, Lin K, et al. Ultrasensitive single-step CRISPR detection of monkeypox virus in minutes with a vest-pocket diagnostic device. Nat Commun. 2024;15(1):3279. Published 2024 Apr 16. doi:10.1038/s41467-024-47518-8
卢水华 教授
教授，主任医师，二级教授，博士生导师
国家感染性疾病临床医学研究中心副主任，深圳市第三人民医院肺病医学部主任
担任：中华医学会结核病分会候任主委，世界卫生组织全球儿童和青少年结核病工作组成员，中国防痨协会学校与儿童结核病分会主委，上海市医学会结核病学分会荣誉主委，广东省医学会结核病学分会主委，第二届国家名医获得者，上海市十佳医师，国家十三五传染病重大专项负责人，国家自然基金重大课题负责人，国家卫健委流感医疗救治专家组成员，国家自然科学基金评审专家，国家药监局新药评审专家，国家药监局医疗器械评审专家，中华医学会医疗鉴定专家，多杂志副主编、编委及审稿专家
长期致力于TB的发病机制、疫苗与诊断技术开发、流行病学及新药临床试验等领域的研究：深入开展大规模人群队列研究，明确我国大学生人群Mtb感染率和BCG保护效率；构建和组织实施“结核感染免疫诊断分层解决方案”，牵头完成我国40年来首个结核I类新药（EC）的临床试验及上市；积极探索TB防控“关口前移”新策略，建立和推广结核潜伏感染早期筛查和精准干预体系；针对当前TB防治瓶颈问题，提出的“一体化综合防控策略”为“End TB”贡献了中国原创理论和技术产品体系。主持包括国家“十三五”传染病重大专项、重大新药创制项目、国家自然基金重大课题在内的国家、省部和市级科研项目11项，合计研究经费超7260万元。在NEJM、Lancet、PNAS等顶级期刊发表学术论文73篇，组织撰写指南与专家共识3篇，主编专著1部。相关成果获“中国防痨协会科学技术奖”一等奖和“上海医学科技奖”三等奖，多次被WHO指南引用
曾昱芹
深圳国家感染性疾病临床医学研究中心，实验员
湖南大学生物学硕士
研究方向为生物医用材料、体外诊断。以主要作者身份在 Acta Biomaterialia，ACS Applied Bio Materials，Cell Proliferation，ACS Applied Materials & Interfaces，Frontiers in Immunology，中国防痨杂志等领域知名期刊发表论文7篇，总IF＞39，其中以第一作者身份发表论文3篇，IF＞19。申请专利一项（已授权），参与国自然面上项目。曾在相关医疗器械企业工作，具备化学发光、血栓弹力图、凝血等相关IVD试剂盒的开发、验证、试产、报证等经验。