华南师范周小明/胡梦露团队Trends in Biotechnology综述丨基于CRISPR系统的一管式核酸诊断策略

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近日，华南师范大学生命科学学院的周小明研究员、胡梦露副研究员团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Trends in Biotechnology发表了题为“Trends in developing one-pot CRISPR diagnostics strategies”的综述。该论文全面介绍了基于CRISPR系统的一管式核酸诊断策略开发的最新进展，为疾病快速诊断和精准医疗提供了新的视角。

将CRISPR检测系统和核酸扩增相结合的必要性

核酸检测技术，作为现代生物医学与公共卫生领域的基石技术，应用领域覆盖传染病防控、遗传性疾病筛查、生物学研究、环境监测及食品安全等。理想的核酸检测技术应兼具高灵敏度、高特异性，同时追求快速、便捷、经济及用户友好的特性。当前，基因测序与PCR技术虽被誉为“金标准”，满足了大多数应用的灵敏度和特异性要求，但其在速度上的局限及对专业实验室环境的依赖，显著降低了用户友好性。相比之下，等温扩增技术简化了操作流程，摆脱了复杂热循环设备的束缚，但其灵敏度的不足及具有非特异性扩增风险的特性，仍制约该技术的广泛应用。

在此背景下，CRISPR技术的崛起为核酸检测领域注入了新的活力。特别是CRISPR/Cas12与CRISPR/Cas13系统凭借其独特的反式切割活性，展现出优异的检测灵敏度，能够精确识别并切割低至pM至fM浓度的核酸靶标。通过工程化改造crRNA与Cas蛋白、优化反式切割探针与反应体系、以及开发多crRNA协同策略，可以进一步提高CRISPR检测的灵敏度。然而，面对分子诊断中常遇到的极低浓度靶标挑战，单纯依赖CRISPR技术的直接检测在灵敏度上尚显不足。因此，将核酸等温扩增技术与CRISPR检测相结合的策略应运而生，这一创新融合有望构建出既高效又精准的核酸检测工具。

实施基于CRISPR系统的一管式核酸检测的挑战

通过将核酸等温扩增与CRISPR检测相结合，科学家们成功开发了经典的CRISPR分子诊断技术，如DETECTR、HOLMES和SHERLOCK。这些早期的CRISPR分子诊断技术虽具有高灵敏度和高特异性，但是需要将核酸扩增和CRISPR检测分步进行，增加了实验操作的复杂性、且极容易发生气溶胶污染（图1）。将CRISPR检测和核酸扩增体系混合到一个试管中是解决这一问题的有效策略。然而，CRISPR系统的靶向切割位点通常需要设计在核酸等温扩增策略的扩增区域内。鉴于在多数临床检测场景下样本中核酸分子的浓度通常较低，CRISPR系统的切割活性可能会在核酸扩增发生之前就破坏靶标序列。因此，将CRISPR系统与核酸等温扩增系统混合可能会显著降低扩增效率，甚至导致扩增失败。尽管实施一管式CRISPR检测存在挑战，但为了推动CRISPR检测技术的进一步应用，这一难题必须被克服。

开发不依赖于CRISPR活性调控的一管式核酸检测策略

传统的分步进行的分子诊断技术，如SHERLOCK、DETECTR和HOLMES，要求将核酸扩增产物手动转移至CRISPR检测系统，这一步骤不仅增加了实验操作的复杂性还容易产生气溶胶污染。为了简化这一过程并降低气溶胶污染，研究人员开展了大量的研究工作。其中一些策略包括将CRISPR检测试剂置于试管的管盖或管壁上，以及基于微流控技术、离心盘或毛细管的自动化检测策略（图2A）。进一步的研究直接将核酸等温扩增与CRISPR检测系统混合（图2B）。尽管这种方法未充分考虑CRISPR切割对核酸扩增的潜在影响，但通过调整反应条件，如反应缓冲液的组成和Cas蛋白的浓度，仍然可以实现高效的核酸检测。另一种有效的策略是利用相分离技术，即向反应体系中添加甘油、蔗糖或琼脂糖等添加剂，来提高一管式核酸检测方法的反应效率（图2C）。这些添加剂通过增加溶液的黏度或密度，减缓生物分子的迁移速度，从而延缓CRISPR系统对核酸模板的切割，降低对核酸扩增的影响。尽管这种一管式CRISPR检测策略简单且高效，但其可重复性、稳定性可能会受到相分离处理方式的影响。

通过调控CRISPR切割活性开发的一管式核酸诊断策略

光控技术作为一种时间和空间上可控、非侵入性、快速响应的调控方法，在基于CRISPR系统的核酸诊断策略的开发中大有可为。两项独立研究表明，通过引入与crRNA互补配对的保护性寡核苷酸（p-oligo）或用6-硝基-3，4-亚甲基二氧苄基氧甲基（NPOM）修饰的T碱基替换crRNA spacer区域中的3个U碱基，实现了对CRISPR/Cas12系统活性的精准调控（图3A和3B）。进一步地，通过将该系统与核酸等温扩增系统相结合，构建了光控一管式核酸诊断方法。尽管该研究证实了通过调控crRNA控制CRISPR/Cas12系统活性的可行性，但现有策略面临两大局限性：一是需针对特定靶向核酸序列定制设计p-oligo或NPOM修饰的crRNA；二是其应用范围仅限于crRNA介导的CRISPR/Cas系统活性调控。最近的一项研究采用crRNA酰化策略，基于光遮蔽剂对CRISPR/Cas12的活性进行光学调节（图3C）。该策略直接作用于RNA碱基的2′-羟基，无需对碱基位置进行优化即可调节其活性。然而，酰化反应的非选择性会屏蔽crRNA的所有碱基，包括那些直接参与Cas12a结合的重复区域内的碱基。这将直接导致完全酰化的crRNA丧失与Cas12a结合的能力，而这种结合对于维持Cas12a的稳定和活性至关重要。考虑到单纯的Cas12a蛋白在室温以上的温度条件下易失活的特性，使用这种光学控制的CRISPR检测方法时，需要格外注意以确保不损失Cas12a的活性，从而保障检测结果的准确性和可靠性。

总结与展望

综上，本文系统地概述了基于CRISPR系统的一管式核酸诊断策略。尽管这些策略在解决CRISPR切割和核酸扩增之间的兼容性问题上取得了显著进展，但技术的进一步发展仍需满足更加用户友好的应用程序的要求。一般来说，任何单一的检测技术都难以满足所有需求，如快速、灵敏、特异、多重、免核酸提取等。因此，特定技术的开发往往需要针对特定的应用场景进行定制化设计。基于CRISPR系统的一管式核酸诊断方法只是解决CRISPR分子诊断应用中遇到的许多障碍的解决方案之一。随着CRISPR诊断技术的不断进步，将有望彻底改变核酸检测领域。

论文作者介绍

周小明 

研究员

基于多学科背景，以交叉技术的角度开展生物、医学分子诊断方法和技术的开发和应用研究工作。研究内容主要聚焦于：“定性和定量核酸检测方法的研究及其在重大疾病核酸标志物、病原微生物的检测应用”。研究成果在PNAS，Nature Protocols，Nature Communications，JACS, Angewandte Chemie，Nano Letters，ACS Nano，Chemical Society Reviews，Analytical Chemistry等期刊发表研究论文。获Annual Review of Analytical Chemistry、ACS Nano等刊物邀请撰写综述论文。申请国家发明专利20项，目前已获得授权14项。获国家万人计划青年拔尖人才，广东省杰出青年科学基金、广东省特支计划（科技创新青年拔尖人才）、广东省优秀青年教师基金、广州市珠江科技新星等人才项目资助。主持国家自然科学基金委“未来生物技术”原创探索重点项目、重大研究计划培育项目、面上等项目。前期研究成果获教育部自然科学二等奖。

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